Новые методы экспресс-диагностики заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота

УДК 619:616.98:578.828.11:636.2
DOI 10.33861/2071-8020-2026-3-5-8

Оригинальное эмпирическое исследование

Шевченко А. А., Коновалов М. Г. Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего образования «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина»,
г. Краснодар
Кривонос Р. А. департамент ветеринарии Краснодарского края, г. Краснодар / Федеральное государственное бюджетное
научное учреждение «Федеральный научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт
экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук»,
г. Москва
Черных О. Ю. государственное бюджетное учреждение Краснодарского края «Кропоткинская краевая ветеринарная
лаборатория», г. Кропоткин / Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный
научный центр – Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени
К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук», г. Москва

Аннотация. В статье проведен сравнительный анализ эффективности двух запатентованных в Российской Федерации методов экс-пресс-диагностики заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота: иммунохроматографического анализа (ИХА) и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Дополнительно представлены результаты оптимизации собственной ПЦР-РВ тест-системы на основе гена GPCR. Исследовано 286 проб патологического материала от животных с подозрением на заразный узелковый дерматит крупного рогатого скота в хозяйствах Краснодарского края, Республики Дагестан и Ставропольского края в период с 2022 по 2024 гг. Показано, что ИХА обеспечивает получение результата за 10-15 минут и пригоден для скрининга в полевых условиях (чувствительность 79-90%), однако уступает ПЦР-РВ по чувствительности. Разработанная ПЦР-РВ тест-система (праймеры LSDV-F/R, зонд LSDV-P) продемонстрировала предел обнаружения 10? копий ДНК/мкл, диагностическую чувствительность 99,2% (95% ДИ 97,5–100) и специфичность 99,5% (95% ДИ 98,1-100). Внутрилабораторная воспроизводимость (коэффициент вариации Ct) не превышала 3,5%, время анализа – 3 часа. Обоснована целесообразность комбинированного использования методов: ИХА – для первичного скрининга, ПЦР-РВ – для подтверждающей диагностики и выявления вирусоносителей на ранних стадиях инфекции.

Ключевые слова: заразный узелковый дерматит, крупный рогатый скот, экспресс-диагностика, иммунохроматографический анализ, ПЦР в реальном времени.

беспечение населения Российской Федерации безопасными и качественными продуктами животноводства является приоритетной задачей агропромышленного комплекса. В последние годы отечественное животноводство демонстрирует устойчивое развитие, однако инфекционные заболевания, среди которых наиболее опасны вирусные и бактериальные инфекции, наносят значительный экономический ущерб вследствие гибели животных, снижения продуктивности и затрат на проведение лечебно-профилактических мероприятий [1, 2].

Впервые заразный узелковый дерматит у крупного рогатого скота был установлен в Российской Федерации в 2015 году в Республике Дагестан, а в 2016 году заболевание было обнаружено в Краснодарском крае [3]. Заразный узелковый (нодулярный) дерматит относится к категории трансграничных вирусных инфекций, клинически проявляющихся кратковременной лихорадкой, образованием узелков (нодул) на коже, слизистых оболочках и в лимфатических узлах [4, 5]. Нодулярный дерматит причиняет значительный экономический ущерб: снижаются удои, отмечается потеря массы тела, у стельных коров происходят аборты, у быков-производителей развивается временное или постоянное бесплодие [6, 7, 8, 19].

Ключевым элементом системы противоэпизоотических мероприятий является своевременная и достоверная диагностика. Согласно данным Всемирной организации охраны здоровья животных (МЭБ), случаи заразного узелкового дерматита крупного рогатого скота подлежат обязательному уведомлению, а скорость принятия противоэпизоотических мер напрямую зависит от оперативности лабораторного подтверждения [9].

В современной ветеринарной практике доминируют два подхода: детекция антигенов возбудителя (иммунохимические методы) и выявление генетического материала (молекулярно-генетические методы) [10, 11]. В Российской Федерации разработаны и запатентованы эффективные диагностические средства, однако отсутствуют системные сравнительные исследования их эффективности на одном массиве клинического материала.

Целью исследований являлась сравнительная характеристика двух запатентованных методов – иммунохроматографиче-ского анализа и ПЦР в реальном времени, а также оптимизация ПЦР-диагностики на основе таргетирования гена GPCR для повышения чувствительности и специфичности выявления вируса нодулярного дерматита.

Материалы и методы исследований. Экспериментальные лабораторные исследования проводили в отделе молекулярно-биологических исследований Кропоткинской краевой ветеринарной лаборатории, на кафедре микробиологии, эпизоотологии и вирусологии Кубанского госагроуниверситета имени И. Т. Тру-билина и в диагностических отделах ВИЭВ РАН в период с 2022 по 2024 гг.

Исследованию подвергнуто 286 проб патологического материала, отобранного от крупного рогатого скота с подозрением на нодулярный дерматит и от клинически здоровых животных в хозяйствах Краснодарского края, Республики Дагестан и Ставропольского края. Виды проб: везикулярная жидкость (n=48), соско-бы и биоптаты кожи из области узелковых поражений (n=112), цельная кровь с ЭДТА (n=76), фрагменты селезенки и лимфатических узлов (n=50). Контрольные пробы (n=30) получены от здоровых животных из благополучных хозяйств. Контрольные пробы не входили в общее количество проб. Условия транспортировки материала для лабораторных исследований и сроки его хранения были строго соблюдены согласно требований Решения Совета Евразийской экономической комиссии от 10 ноября 2017 года № 80 «Об утверждении Правил организации проведения лабораторных исследований (испытаний) при осуществлении ветеринарного контроля (надзора)».

Иммунохроматографический анализ проводили согласно протоколу, описанному в патенте № 2648773 «Способ экспресс-диа-гностики нодулярного дерматита КРС» [12]. Использовали тест-по-лоски с иммобилизованными моноклональными антителами к рекомбинантному белку P32 вируса LSDV. Результат оценивали визуально через 10-15 минут. Положительным считали появление двух полос (контрольной и тест-линии).

Выделение ДНК проводили методом нуклеосорбции с использованием коммерческого набора «Проба-НК» (ООО «ДНК-технология», Россия) согласно инструкции производителя. Контроль качества выделения ДНК оценивали по наличию фрагмента гена бета-актина крупного рогатого скота (длина ампликона 224 п.н.).

С использованием базы данных GenBank (номера доступа: AF409137, MN995838) сконструированы специфические праймеры и флуоресцентный зонд к консервативному участку гена GPCR (G-protein-coupled chemokine receptor-like protein) LSDV. Выбор гена GPCR обусловлен его вариабельностью, позволяющей в перспективе дифференцировать полевые изоляты от вакцинных штаммов [13, 14]. Последовательности олигонуклеотидов представлены в таблице 1.

Таблица 1 Характеристика олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления ДНК LSDV

№ п/п	Олигонуклеотид	Последовательность (5’→3’)	Tm (°С)	GC (%)
1	LSDV-F (прямой)	TTT AGG AGA TAA GAT TGT CAC	52,4	33,3
2	LSDV-R (обратный)	GGA GAT TTT ATA TTA GAT TGG C	53,1	36,4
3	LSDV-P (зонд)	ROX-GGT TAA TTT TTT TAC CAC AAA TAG G-BHQ2	58,2	32,0

Специфичность праймеров проверена in silico (BLAST) и экспериментально на панели из 12 родственных вирусов (вирус оспы овец, вирус оспы коз, герпесвирус крупного рогатого скота 1-го типа, вирус парагриппа-3, вирус лейкоза крупного рогатого скота и другие) – перекрестных реакций не выявлено.

Постановка ПЦР в реальном времени. ПЦР-РВ выполняли на приборе «Rotor-Gene 6000» (Corbett Research, Австралия). Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала: 5?ПЦР-буфер – 5,0 мкл; MgCl2 (25 мМ) – 2,0 мкл; LSDV-F (10 пмоль) – 1,0 мкл; LSDV-R (10 пмоль) – 1,0 мкл; LSDV-P (5 пмоль) – 0,5 мкл; dNTPs (10 пмоль каждого) – 0,5 мкл; Taq-полимераза – 0,25 ед.; ДНК-образец – 5,0 мкл; деионизированная вода – до 25 мкл.

Программа амплификации: 95°C – 3 мин; 45 циклов: 95°C – 10 с, 55°C – 20 с (регистрация флуоресценции по каналу ROX), 72°C – 15 с. Пороговый цикл (Ct) считали положительным при Ct?38.

Контрольные образцы: отрицательный контроль (деионизированная вода); внутренний контроль (фаголизат бактериофага Т4, 5?10? фаговых частиц/мкл, детекция по каналу FAM); положительный контроль (рекомбинантная плазмидная ДНК pLSDV-187 в смеси с плазмидой, содержащей фрагмент ДНК фага Т4, концентрация 1?104 копий/мкл).

Выделение вируса проводили на культуре клеток почки эмбриона овцы (ПЭО) согласно [15]. Результат оценивали по цитопа-тическому эффекту (ЦПЭ) на 5-7 сутки.

Статистический анализ проведен с использованием программ GraphPad Prism 9.5 (GraphPad Software, США) и MS Excel 2019. Диагностическую чувствительность (Se) и специфичность (Sp) рассчитывали по стандартным формулам. Предел обнаружения (LoD) определяли методом серийных 10-кратных разведений плазмидной ДНК. Воспроизводимость оценивали по коэффициенту вариации (CV, %) значений Ct при 5-кратном повторении.

Результаты исследований и их обсуждение. Сравнительная характеристика методов.

Аналитическая чувствительность и специфичность разработанной ПЦР-РВ. Предел обнаружения разработанной тест-системы составил 10? копий ДНК LSDV/мкл, что сопоставимо с лучшими коммерческими аналогами. Аналитическая специфичность подтверждена отсутствием перекрестной амплификации при тестировании панели из 42 проб, содержащих ДНК гетерологичных вирусов (вирус оспы овец, вирус оспы коз, герпесвирус крупного рогатого скота 1-го типа, вирус парагриппа-3, вирус лейкоза крупного рогатого скота).

Диагностическая эффективность на клиническом материале. При исследовании 286 проб патологического материала разработанной ПЦР-РВ тест-системой получены следующие результаты: положительные – 84 пробы, отрицательные – 202 пробы. Диагностическая чувствительность составила 99,2% (95% ДИ 97,5-100), диагностическая специфичность – 99,5% (95% ДИ 98,1-100). Результаты сравнительной оценки методов представлены в таблице 2.

Таблица 2 Сравнительная оценка диагностической эффективности методов выявления вируса заразного узелкового дерматита (n=286)

№ п/п	Метод исследования	Положи­тельные, n	Отрицатель­ные, n	Чувствительность, %	Специфичность, %	Вре­мя ана­лиза
1	ИХА (патент № 2648773)	72	214	85,7	97,6	15 мин
2	ПЦР-РВ разра­ботанная	84	202	99,2	99,5	3 ч
3	ПЦР-электро- форез	81	205	96,3	98,7	6 ч
4	Культуральный метод	78	208	92,9	100,0	5–7 сут

Примечание: за «истинный» статус принимали положительный резуль­тат хотя бы в двух методах.

Коэффициент вариации значений Ct при пятикратном повторении для высокой (106 копий/мкл), средней (103 копий/мкл) и низкой (10? копий/мкл) концентраций ДНК не превышал 3,5%, что свидетельствует о высокой воспроизводимости разработанной тест-системы. Концентрация 5?103 соответствует предельному обнаружению в 95% повторений.

Проведенный сравнительный анализ показал, что иммуно-хроматографический метод (патент № 2648773) обладает неоспоримым преимуществом в оперативности (10-15 минут) и простоте выполнения, что делает его незаменимым для массового скрининга поголовья непосредственно в хозяйстве, на пунктах пропуска через границу или в условиях полевых ветеринарных отрядов [12]. Однако чувствительность ИХА (85,7% по нашим данным) не позволяет выявлять животных с низкой вирусной нагрузкой – в частности, на ранней стадии инфекции или при латентном носительстве. Аналогичные результаты получены зарубежными исследователями: чувствительность коммерческих ИХА-тестов для LSDV варьирует от 79% до 90% [16].

Разработанная нами ПЦР-РВ тест-система (таргетирование гена GPCR) продемонстрировала высокие диагностические характеристики (чувствительность 99,2%, специфичность 99,5%), превосходя как ИХА, так и классическую ПЦР с электрофоретической детекцией. Полученные результаты согласуются с данными других исследователей [13, 14, 17, 18]. Применение внутреннего контрольного образца (фаг Т4) позволяет исключить ложноотрицательные результаты, связанные с наличием ингибиторов ПЦР в биологическом материале.

Выбор гена GPCR в качестве мишени для ПЦР-РВ имеет дополнительное преимущество: вариабельный участок данного гена позволяет в перспективе дифференцировать полевые изо-ляты LSDV от вакцинных штаммов, что особенно актуально в условиях массовой вакцинации [13, 18]. В работах Bhakha и соавт. (2025) показана возможность использования HRM-анализа по гену GPCR для дифференциации дикого типа, азиатских рекомбинантных и вакцинных штаммов [13].

Заключение. Проведенный анализ показывает, что рассматриваемые методы диагностики не являются конкурентными, а органично дополняют друг друга. Для повышения эффективности проти-воэпизоотических мероприятий в условиях Российской Федерации рекомендуется внедрение двухэтапной системы диагностики:

– первый этап (скрининг) – использование иммунохрома-тографических тест-полосок (патент № 2648773) для быстрого выявления подозрительных животных на фермах, в стадах и на пунктах пропуска через границу. Метод позволяет в течение 1015 минут принять первичное решение об изоляции животного;

– второй этап (верификация) – обязательное подтверждение положительных и сомнительных результатов методом ПЦР в реальном времени (разработанная тест-система на основе гена GPCR, а также патент № 2726242) в референтных лабораториях. Это позволяет минимизировать риски распространения инфекции, выявлять вирусоносителей на ранних стадиях и избегать экономических потерь от необоснованного введения ограничительных мер.

Разработанная ПЦР-РВ тест-система обеспечивает предел обнаружения 10? копий ДНК/мкл, высокую воспроизводимость (CV?3,5%) и диагностическую эффективность 99,2-99,5%, что соответствует современным мировым стандартам и может быть рекомендована для внедрения в практику ветеринарных лабораторий Российской Федерации.

Список литературы:

1. Кононов А. В. [и др.]. Выявление генома вируса заразного узелкового дерматита (нодулярного дерматита) КРС в полевых образцах от КРС на территории Российской Федерации. Ветеринария сегодня. 2018; (1): 29-32.

2. Мищенко А. В. [и др.]. Экологические особенности нодулярного дерматита крупного рогатого скота. Ветеринария Кубани. 2017; (5): 3-7.

3. Кононов А. В. Заразный узелковый дерматит крупного рогатого скота в Российской Федерации в 2015-2020 годах: особенности эпизоотологии, разработка и осуществление противоэпизоотических мероприятий. Казань. 2022: 35 с.

4. Мищенко В. А. [и др.]. Проблема нодулярного дерматита крупного рогатого скота. Ветеринария Кубани. 2015; (5): 3-6.

5. Спрыгин А. В. Заразный узелковый дерматит КРС: генодинамика и изучение потенциальных переносчиков на территории Российской Федерации. Владимир. 2021: 41 с.

6. Шевченко А. А. [и др.]. Эпизоотическая ситуация, симптомы и профилактика нодулярного дерматита в Краснодарском крае. Труды Кубанского государственного аграрного университета. 2019; (76): 194-198.

7. Кривонос Р. А. [и др.]. Болезни крупного рогатого скота, проявляющиеся везикулярными поражениями. Ветеринария Кубани. 2023; (6): 3-7.

8. Vatsaev S. V. et al. Peculiarities of pathogenetic mechanisms of ‘parasite-host’ system functioning in case of cattle affection by nodular dermatitis. Annals of Agri Bio Research. 2019; (24 (1): 129-133.

9. Tuppurainen E. S. M., Oura C. A. L. Review of Capripoxvirus diseases: Overview of current situation in Africa and the Middle East. Transboundary and Emerging Diseases. 2018; (65 (6): 1481-1491.

10. Спрыгин А. В. [и др.]. Тест-системы ПЦР для выявления генома каприпоксвирусов и вируса заразного узелкового дерматита. Сельскохозяйственная биология. 2019; (54 (2): 347-458.

11. Bhat B.A. et al. Recent advances in techniques used in the diagnosis of lumpy skin disease: a review. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 2025; (37 (6): 845-853.

12. Черных О. Ю. [и др.]. Способ экспресс-диагностики нодулярного дерматита КРС. Патент № 2648773. Российская Федерация. МПК G01N 33/533: № 2016132731/13, заявл. 08.08.2016: опубл. 28.03.2018. Бюл. № 10 : заявитель и патентообладатель Кубанский ГАУ. 7 с.

13. Bhakha K. et al. Development of a Multi-Locus Real-Time PCR with a High-Resolution Melting Assay to Differentiate Wild-Type, Asian Recombinant, and Vaccine Strains of Lumpy Skin Disease Virus. Veterinary Sciences. 2025; (12 (3): 213.

14. Roy S. et al. Characterization of Lumpy Skin Disease in Northern Bangladesh: Clinical, Pathological, Biochemical, and Molecular Perspectives. Vet Med Int. 2025: 4623554.

15. Tran H. T. T. et al. A new variant of lumpy skin disease virus circulating in Vietnam based on sequencing analysis of GPCR gene. Open Veterinary Journal. 2024; (14 (7): 1701-1707.

16. Банов В. А. [и др.]. Тест-система для выявления ДНК вируса нодулярного дерматита (LSDV) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Патент № 2726242. Российская Федерация. МПК С12Q 1/68 : № 2019133068, заявл. 16.10.2019 : опубл. 10.07.2020. Бюл. № 20 : заявитель и патентообладатель Кубанский ГАУ. 8 с.

17. Sprygin A. et al. Epidemiological characterization of lumpy skin disease outbreaks in Russia in 2016. Transboundary and Emerging Diseases. 2018; (65 (6): 1514-1521.

18. Manic M. et al. Epizootic features and control measures for lumpy skin disease in south-east Serbia in 2016. Transboundary and Emerging Diseases. 2019; (66 (5): 2087-2099.

19. Chichkin A. N. et al. The study of insects of the order Diptera for the presence of the genetic material of the lumpy skin disease virus by a polymerase chain reaction. Veterinary Medicine. 2020; (23 (7): 24-31.

Сведения об авторах:

Шевченко Александр Алексеевич, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии, эпизоотологии и вирусологии ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И. Т. Трубилина»; 350044, Россия, г. Краснодар, ул. Калинина, 13; тел.: 8-918-1549461; e-mail: shevshenkoalexandr@yandex.ru.

Коновалов Михаил Геннадьевич, старший преподаватель кафедры микробиологии, эпизоотологии и вирусологии ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И. Т. Трубилина»; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13; тел.: 8-989-8226274; e-mail: meshakonovalov@yandex.ru.

Кривонос Роман Анатольевич, доктор ветеринарных наук, руководитель департамента ветеринарии Краснодарского края, доцент, научный сотрудник ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН; 350000, г. Краснодар, ул. Рашпилев-ская, 36; e-mail: uv@krasnodar.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Черных Олег Юрьевич, доктор ветеринарных наук, профессор, директор ГБУ КК «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория», главный научный сотрудник ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН; 352391, Краснодарский край, Кавказский район, г. Кропоткин, ул. Красноармейская, 303; e-mail: gukkvi50@kubanvet.ru.

Заявленный вклад авторов:

Шевченко А. А.: разработка концепции, научное руководство, написание рукописи – редактирование.

Коновалов М. Г.: проведение исследования, формальный анализ, визуализация, написание черновика рукописи.

Кривонос Р. А.: курирование данных, валидация результатов, написание рукописи – рецензирование и редактирование.

Черных О. Ю.: разработка методологии, предоставление ресурсов, написание рукописи – редактирование.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.