Иммуногенная активность антигенов штаммов вируса Парагриппа-3 крупного рогатого скота при различных способах культивирования

УДК 57.083.3:578.831.1:616-097:616.98
DOI 10.33861/2071-8020-2026-2-3-6

Оригинальное эмпирическое исследование

Мухаммадиев Риш. С., Мухаммадиев Рин. С., Каримуллина И. Г., Хусаинова Г. И., Сорокина Д. А., Яруллин А. И., Галеева А. Г., Ефимова М. А.
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и
биологической безопасности», г. Казань

Аннотация. В системе мероприятий, которые направлены на борьбу с инфекцией крупного рогатого скота, вызываемой вирусом парагриппа-3, ключевое место занимает вакцинопрофилактика. Несмотря на существующие ветеринарные вакцины и значительные достижения в области их разработки, бычий вирус ПГ-3 остается одним из факторов, способствующих развитию комплекса респираторных заболеваний скота в животноводстве. Эффективность вакцин определяется технологией их производства, включая способом выращивания вирусных штаммов для получения их биомассы или антигенов. Настоящая работа посвящена сравнительной оценке иммуногенного потенциала нативных и концентрированных антигенов штаммов «SF-4» и «ПТК-45/86» вируса ПГ-3, выращенных стационарным и роллерным способами. Установлено, что после 108 ч стационарного выращивания штаммов «SF-4» и «ПТК-45/86» титры инфекционной активности последних достигали максимальных значений и составили, соответственно, 6,23±0,06 и 5,01±0,02 lg ТЦД50/мл, после 132 ч культивирования на роллерной установке – соответственно, 8,16±0,05 и 6,58±0,03 lg ТЦД50/мл. На основе вируссодержащих культуральных жидкостей и суспензий ПЭГ-осажденных протеинов вирусных штаммов нами приготовлены экспериментальные образцы антигенных препаратов. Образцы полученных препаратов обладали способностью формировать у кроликов иммунный ответ, что подтверждалось выявленными в реакции торможения гемагглютинации специфическими антителами к антигенам вируса ПГ-3. Значение титра антител были наиболее высокими в сыворотках крови животных, которым вводили образец препарата на основе нативных антигенов штамма «SF-4», выращенного роллерным способом, и составило 1:560±80.

Ключевые слова: бычий вирус парагриппа 3, способы выращивания, антигены, стерильность, иммуногенный потенциал, крупный рогатый скот, скотоводство.

Инфекция, вызываемая вирусом парагриппа-3 крупного рогатого скота, по-прежнему остается одной из серьезных проблем современного животноводства. ПГ-3 широко распространен в России и мире: в 2024–2025 гг. регистрировали вспышки этой инфекции в большинстве регионов страны в различных животноводческих предприятиях с охватом от 5% до 90% телят [1, 2].

Результаты многочисленных эпизоотологических и молекулярно-диагностических исследований подтверждают значимую роль вируса ПГ-3, с частотой выявления у животных в пределах 4-13% [3, 4]. Эпизоотологические данные указывают на устойчивую циркуляцию возбудителя в популяции крупного рогатого скота и его значительный вклад в формирование комплекса респираторных заболеваний.

Заболевание вызывает значительные экономические потери вследствие снижения продуктивности, развития респираторных патологий, появления вторичных бактериальных осложнений и возможной гибели животных [2, 5]. В условиях интенсивного содержания и высокой плотности поголовья риск возникновения и распространения эпизоотий существенно возрастает, особенно под воздействием различных стрессовых факторов. Наряду с этим в скотоводческих предприятиях с современными технологиями существует повышенный риск заноса возбудителя инфекции извне, что обусловлено активным перемещением животных, импортом племенного поголовья, а также недостаточным соблюдением ветеринарно-санитарных норм в процессе транспортировки и каран-тинирования [1, 5]. В связи с этим, надёжная профилактика ПГ-3 становится приоритетной задачей животноводства.

Постоянный рост требований к качеству, безопасности и эффективности вакцин обуславливает необходимость точной и комплексной оценки иммуногенности антигенов в условиях, максимально приближенных к промышленным производственным платформам [6]. Это, в свою очередь, требует сопоставления данных, полученных при использовании различных методов культивирования, для выявления оптимальных технологических условий, обеспечивающих наибольшую иммунологическую активность и стабильность вакцинных препаратов.

Стационарное культивирование обеспечивает более равномерную адгезию клеток и меньшее механическое воздействие [6, 8], что способствует сохранению антигенной структуры вируса ПГ-3, но приводит к неравномерному распределению питательных веществ, кислорода и углекислого газа, потенциально снижая стабильность антигенов на поздних стадиях. Роллерное культивирование, напротив, способствует увеличению площади поверхности контакта за счёт постоянного вращения культуральных бутылей (0,5-1 об/мин) [6, 9]. Такое сочетание с улучшенным газообменом и эффективным удалением метаболитов создаёт оптимальные условия для усиленной пролиферации клеток, что, в свою очередь, приводит к повышению титра вируса (до 7,2-8,5 lg ТЦД50/мл) и инфекционной активности, косвенно свидетельствующих о более высокой антигенной стабильности вируса.

В связи с этим, целью исследования явилась сравнительная оценка иммуногенного потенциала нативных и концентрированных антигенов штаммов «SF-4» и «ПТК-45/86» вируса ПГ-3 крупного рогатого скота, полученных при стационарном и роллерном способах культивирования.

Материалы и методы исследований. Объектами исследований служили штаммы «SF-4» и «ПТК-45/86» ПГ-3 Государственной коллекции микроорганизмов (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», Казань). В работе использовали клетки легкого эмбриона коровы ЛЭК (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», Казань), выращивание которых осуществляли в ростовой среде, включающей Игла MEM, 0,5% ГЛА и 199 (соотношение 1:1:1) с 2,5 % сыворотки крови эмбриональной телячьей (БиолоТ, Россия) с добавлением гентамицина (PanEco, Россия) в концентрации 40,0 мкг/мл, при 37,0°С и 5,0% СО2 [8, 9].

Культивирование вирусов. Накопление биомассы штаммов вируса ПГ-3 крупного рогатого скота проводили на клетках ЛЭК двумя методами: стационарным (СС) в стеклянных матрасах и роллерным (РС) в бутылях на роллер-инкубаторе при условиях, описанных ранее [10]. Инфицирование клеточного монослоя осуществляли вирусным материалом в дозах 0,25±0,03 ТЦД50/клет-ку (СС) и 0,35±0,05 ТЦД50/клетку (РС). Вируссодержащую культуральную жидкость (ВКЖ) собирали через 96-144 ч инкубации.

Определение инфекционной активности. Титрование ВКЖ для оценки инфекционной активности проводили на клетках ЛЭК. Образцы последовательно десятикратно разводили в среде в лунках культуральных панелей (PanEco, Россия), затем переносили на свежий монослой клеток. Инкубацию инфицированных культур осуществляли при 37,0°С и 5,0% CO2. Цитопатическое действие (ЦПД) оценивали ежедневно микроскопией, титр вируса рассчитывали по МУ 3.3.2.1758-03 [11].

Определение биологической активности вирусов ПГ-3 в реакции гемагглютинации (РГА) осуществляли по стандартной методике согласно ГОСТ 33871-2016. Реакцию ставили в одноразовых полистироловых панелях для иммунологических исследований (Медполимер, Россия).

Концентрирование антигенов штаммов вируса ПГ-3 проводили осаждением из ВКЖ полиэтиленгликолем (ПЭГ-6000) и хлоридом натрия (NaCl) (PanEco, Россия): к 15,0 мл ВКЖ добавляли ПЭГ-6000 (29,0 мг/мл) и NaCl (80,0 мг/мл), инкубировали при 4,0°С в течение 18-20 ч. Смесь центрифугировали при 8500 об/мин, 60 мин. Осадок вирусных антигенов ресуспендировали в 0,02 М фосфатно-солевом буфере (pH 7,2-7,4). Концентрацию вирусного белка определяли спектрофотометрически на приборе NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, США).

ВКЖ и суспензии ПЭГ-осажденных концентратов антигенов (от штаммов, выращенных стационарным и роллерным методами) инактивировали формалином до конечной концентрации 0,4%.

Стерильность образцов антигенных препаратов анализировали прямым посевом последних на среды согласно ГОСТ 280852013 [12]. Инкубацию посевов осуществляли в течении 10 суток при 37,0°С в МПА, МПБ и МППБ, при 22,0°С – в агаре Сабуро. Образцы препаратов считали стерильными в случае отсутствия помутнения или формирования колоний бактерий и грибов на указанных средах.

Оценку иммуногенного потенциала антигенных препаратов проводили на 16 кроликах породы шиншилла (возраст 2,5-2,7 кг). Животных разделили на 9 групп по 4 особи (n=4) с внутрикожным введением препаратов по 0,5 мл (табл. 1).

Таблица 1 Экспериментальные группы животных

Груп­па	Тип антигена	Штамм	Метод культи­вирования	Обра­зец
1	Нативный	SF-4	Стационарный (СС)	ВКЖ
2	Нативный	SF-4	Роллерный (РС)	ВКЖ
3	Нативный	ПТК-45/86	Стационарный (СС)	ВКЖ
4	Нативный	ПТК-45/86	Роллерный (РС)	ВКЖ
5	Концентрирован­ный	SF-4	Стационарный (СС)	ПЭГ- осадок
6	Концентрирован­ный	SF-4	Роллерный (РС)	ПЭГ- осадок
7	Концентрирован­ный	ПТК-45/86	Стационарный (СС)	ПЭГ- осадок
8	Концентрирован­ный	ПТК-45/86	Роллерный (РС)	ПЭГ- осадок
9 (кон­троль)	–	–	–	Буфер (0,02 М ФБР)

Повторное введение антигенных препаратов и контрольного буфера кроликам проводили через 14 суток после первой иммунизации. Кровь для анализа сывороток на специфические антитела методом реакции торможения гемагглютинации (РТГА) отбирали на 30, 60, 90, 120, 150 и 180 сутки после ревакцинации.

Экспериментальных животных содержали в виварии с кормлением стандартным комбикормом по нормам ГОСТ 33215-2014. Исследования in vivo проводили в соответствии с Директивой ЕС 2010/63/EU о защите животных, используемых в научных целях.

Анализ специфических антител к антигенным препаратам исследуемых штаммов вируса ПГ-3 проводили в сыворотках крови кроликов методом реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в соответствии с «Методическими указаниями по лабораторной диагностике вирусных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота» [13]. Реакцию ставили в одноразовых полистироловых панелях для иммунологических исследований (Медполимер, Россия).

Оценку результатов экспериментов проводили с использованием пакета электронных таблиц Microsoft Excel 2016 («Windows», США). Для статистической обработки применяли t-критерий Стьюдента, различия считали статистически значимыми при уровне значимости p?0,05.

Результаты исследований и их обсуждение. Одним из значимых критериев рентабельности вакцин на рынке ветеринарных биопрепаратов является технологически и экономически обоснованный подход к их получению [10, 14]. В этом контексте особую важность приобретает выбор способа выращивания клеток и вирусных штаммов, обеспечивающего накопление достаточного количества вирусной биомассы.

При выращивании штаммов ПГ 3 на клетках ЛЭК в стеклянных матрасах и роллерных бутылях установлены достоверные различия (p<0,05) в их продуктивности (рисунок 1).

 

Рис. 1. Инфекционная активность образцов ВКЖ штаммов ПГ-3, выращенных разными способами. Представлены максимальные значения титров инфекционной активности

После 108 ч стационарного культивирования различия меж­ду штаммами по уровню инфекционной активности составляли 1,22 lg ТЦД50/мл, что указывает на более низкую репродукцию штамма «ПТК 45/86» по сравнению с «SF 4». При переходе к рол­лерному способу выращивания для обоих штаммов отмечен рост инфекционного титра в среднем на 1,75 lg ТЦД50/мл, однако штамм «SF 4» превосходил «ПТК 45/86» по уровню вирусопродукции.

Таблица 2 Показатели репродукции штаммов вируса ПГ-3 при стационарном и роллерном культивировании

Штамм	Метод куль­тивирования	Титр РГА (1/[N])	Концентрация вирусного белка (мг/мл)
SF-4	СС	1:26,70±0,58	0,47±0,02
SF-4	РС	1:235,00±5,82	2,13±0,05
ПТК-45/86	СС	1:21,30±0,41	0,38±0,01
ПТК-45/86	РС	1:224,0±5,36	1,05±0,03

При роллерном способе культивирования для обоих вирусов отмечается выраженное увеличение гемагглютинирующей ак­тивности и концентрации вирусного белка в ВКЖ по сравнению со стационарным методом (табл. 2). Для штамма «SF-4» отмечено повышение титров РГА с 1:26,7±0,58 до 1:235±5,82 при росте содержания белка в 4,53 раза. Аналогичная тенденция просле­живалась и для штамма «ПТК-45/86», где титр РГА возрастал с 1:21,3±0,41 до 1:224±5,36, а концентрация белка – в 2,76 раза. Полученные данные свидетельствуют о более высоком репродук­тивном и антигенпродуцирующем потенциале штамма «SF 4», что делает его более предпочтительным в качестве производственно­го для изготовления вакцины.

На рисунке 2 представлена типичная картина ЦПД клеток ЛЭК, инфицированных штаммами вируса ПГ-3.

 

Рис. 2. Морфологические изменения клеток ЛЭК после инфицирования вирусом ПГ 3: 1 – контрольные клетки; 2 – клетки через 96 ч после инфицирования штаммом «SF 4»; 3 – клетки через 96 ч после инфицирования штаммом «ПТК 45/86» (увеличение x 100)

 

Рис. 3. Иммуногенный потенциал антигенных препаратов штаммов «SF 4» и «ПТК 45/86», выращенных различными способами

Сравнительная оценка иммуногенного потенциала препаратов, полученных на основе нативных и концентрированных антигенов штаммов «SF 4» и «ПТК 45/86», выращенных различными способами, проведена на модели кроликов. Установлено, что антигенные препараты указанных вирусов индуцируют у животных формирование специфического иммунного ответа, что подтверждается выявлением в РТГА антител к вирусу ПГ-3 (рисунок 3).

Наиболее высокие значения титров антител отмечены в сыворотках крови животных группы 2, которым вводили препарат на основе нативных антигенов штамма «SF 4», выращенного роллерным способом; средний титр составил 1:560 ± 80. Относительно высокий уровень антител (1:200 ± 40) выявлен также у животных группы 8, иммунизированных препаратом на основе концентрированных антигенов штамма «ПТК 45/86», культивированного на роллерной установке.

Сравнительный анализ уровня специфических антител в сыворотках крови иммунизированных животных показал, что в группах 1, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 титры антител были ниже, соответственно, в 4,0; 14,0; 7,0; 14,0; 3,5; 8,0 и 2,8 раза (p < 0,05) по сравнению с группой 2.

Максимальные значения титров специфических антител у иммунизированных животных регистрировали на 30-е сутки после введения антигенных препаратов. В последующие сроки отмечалось постепенное снижение уровня антител, при этом более быстрое падение титров наблюдали у животных, иммунизированных неконцентрированными антигенами штамма «ПТК 45/86» (табл. 3).

Таблица 3 Динамика титров антител к ПГ-3 в сыворотке крови кроликов, иммунизированных антигенами, полученными роллерным способом

Группа животных	Титры антител (1/[N]) в РТГА	Последо­вательность 5’-3’	Tm, °C	Длина ПЦР продукта
	30-е сутки	60-е сутки	90-е сутки	120-е сутки
1 (n = 4)*	560±80	520±200	440±120	240±80
2 (n = 4)**	200±40	190±110	100±20	55±15
3 (n = 4)***	0	0	0	0

Примечание: * – животным, которым вводили образец препарата на основе нативных антигенов вирусного штамма «SF-4»; ** – животным, которым вводили образец препарата на основе концентрированных антигенов вирусного штамма «ПТК-45/86»; *** – животным, которым вводили основу образцов антигенных препаратов (контроль)

Таким образом, по результатам проведённых исследований установлено, что антигенная активность препаратов, полученных из антигенов штаммов вируса ПГ-3, возрастает при использовании роллерного способа культивирования и достигает максимальных значений у концентрированных антигенных форм, что свидетельствует о высокой эффективности выбранного технологического подхода для усиления их иммуногенности.

С учётом полученных данных об иммуногенном потенциале препаратов ПГ-3, технологически и экономически обоснованным является следующий подход: для получения антигенов штамма «SF 4» целесообразно использовать роллерное культивирование без стадии концентрирования, тогда как для штамма «ПТК 45/86» оптимальным является тот же способ выращивания с последующим концентрированием.

Заключение. В результате проведённых исследований установлено, что экспериментальные антигенные препараты, полученные на основе вируссодержащих культуральных жидкостей штаммов «SF 4» и «ПТК 45/86», выращенных различными способами, а также концентрированные антигены в разной степени эффективно стимулируют у животных формирование специфического иммунного ответа. Дальнейшие исследования по повышению иммуногенной активности антигенов указанных вирусных штаммов открывают перспективы их применения в качестве основы высокоэффективных вакцин против ПГ-3.

Список литературы:

1. Красочко П. А., Красочко И. А., Пчельников А. В., Дмитриев К. А. Анализ возможных путей заноса возбудителей вирусных пневмоэнтеритов с импортируемыми дикими и сельскохозяйственными животными в Смоленской и Тверской областях. Вестник АПК Верхневолжья. 2025; (2 (70): 18-25.

2. O’Donoghue S., Waters S. M., Morris D. W., Earley B. A comprehensive review: bovine respiratory disease, current insights into epidemiology, diagnostic challenges, and vaccination. Vet. Sci. 2025; (12 (8): 778.

3. Milicevic V., Solaja S., Glisic D. et al. Bovine parainfluenza virus 3 and bovine respiratory syncytial virus: dominant viral players in bovine respiratory disease complex among Serbian cattle. Animals. 2024; (14 (10): 1458.

4. Zulauf B., Pastey M. K. Field-validated multiplex RT-qPCR for simultaneous detection of bovine respiratory syncytial virus and bovine parainfluenza virus-3 in bovine respiratory samples. Front. Vet. Sci. 2025; (12): 1645647.

5. Каримуллина И. Г., Яруллин А. И., Мухаммадиев Р. С. [и др.]. Серологический мониторинг респираторных и желудочно-кишечных заболеваний крупного рогатого скота в молочных комплексах Приволжского федерального округа. Ветеринария Кубани. 2025; (2): 13-15.

6. Каримуллина И.Г., Гумеров В.Г., Яруллин А.И. [и др.]. Усовершенствование технологии культивирования вирусов парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита для изготовления ассоциированных вакцин крупного рогатого скота. Ученые записки Казанской академии ветеринарной медицины им. Н. Э. Баумана. 2024; (259 (3): 78-82.

7. Бехзадпур Д., Белоусова Р.В., Иванов И.В. Обоснование оптимальных для изготовления вакцин режимов культивирования вируса парагриппа-3 на перевиваемых линиях клеток. Военно-медицинский журнал. 2013; (4 (334): 27-31.

8. Мухаммадиев Р. С., Хусаинова Г. И., Мухаммадиев Р. С. [и др.]. Оптимизация условий культивирования штаммов вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота. Ветеринарный врач. 2025; (4): 74-80.

9. Мухаммадиев Р. С., Мухаммадиев Р. С., Каримуллина И. Г. [и др.]. Способ гипериммунизации животных для получения гибридных клеток - продуцентов моноклональных антител к бычьему аденовирусу. Ветеринарный врач. 2025; (5): 73-80.

10. Каримуллина И. Г., Яруллин А. И., Мухаммадиев Р. С. [и др.]. Подбор условий выращивания бычьего герпесвируса и бычьего вируса вирусной диареи на культурах клеток. Ветеринарный врач. 2025; (2): 68-76.

11. МУ 3.3.2.1758-03. 3.3.2. Медицинские иммунобиологические препараты. Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа. Методические указания: утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 28.09.2003: дата введения. Минздрав России. 2004: 132 с.

12. ГОСТ 28085-2013. Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Методы контроля стерильности. Стандартин-форм. 2014: 15 с.

13. Методические указания по лабораторной диагностике вирусных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота. Минсельхоз России. 2014; № 13-7-2/2162.

14. Мухаммадиев Р. С., Каримуллина И. Г., Яруллин А. И. [и др.]. Очистка антигенов штамма «ТК-А (ВИЭВ)-В2» бычьего альфагерпесвируса биотипа 1. Ветеринария Кубани. 2025; (3): 3-7.

Сведения об авторах:

Мухаммадиев Ринат Салаватович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отделения вирусологических и ультраструк-турных исследований ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, г. Казань, ул. Научный городок-2; тел.: 8-987-4214127; е-mail: tanirtashir@mail.ru.

Каримуллина Ильсияр Габделгазизовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отделения вирусологических и ультраструктур-ных исследований ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, г. Казань, ул. Научный городок-2; тел.: 8-904-7699225; е-mail: 89047699225@mail.ru.

Хусаинова Гульнара Ильдусовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отделения вирусологических и ультраструктурных исследований ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, г. Казань, Научный городок-2; тел.: 8-917-2627283; е-mail: gulnarai13@yandex.ru.

Сорокина Диана Анатольевна, младший научный сотрудник отделения вирусологических и ультраструктурных исследований ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, г. Казань, ул. Научный городок-2; тел.: 8-927-8875729; е-mail: diana-sorokina2013@mail.ru.

Яруллин Айнур Ильнурович, кандидат биологических наук, заведующий отделения вирусологических и ультраструктурных исследований ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, г. Казань, ул. Научный городок-2; тел.: 8-905-3174170; e-mail: abii@mail.ru.

Галеева Антонина Глебовна, кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник отделения вирусологических и ультраструктурных исследований ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, г. Казань, ул. Научный городок-2; тел.: 8-897-2338616; е-mail: antonina-95@yandex.ru.

Ефимова Марина Анатольевна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник отделения вирусологических и ультраструктурных исследований ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, г. Казань, ул. Научный городок-2; тел.: 8-905-3770771; е-mail: marina-2004r@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Мухаммадиев Ришат Салаватович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отделения вирусологических и ультраструктурных исследований ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», 420075, г. Казань, ул. Научный городок-2; тел.: 8-939-3728789; е-mail: tashir9891@mail.ru.

Заявленный вклад авторов:

Мухаммадиев Риш.С.: разработка концепции, научное руководство, написание рукописи – редактирование.

Мухаммадиев Рин.С.: написание черновика рукописи, визуализация.

Каримуллина И.Г.: административное руководство исследовательским проектом.

Хусаинова Г.И.: проведение исследования, курирование данных.

Сорокина Д.А.: проведение исследования.

Яруллин А.И.: валидация результатов.

Галеева А.Г.: формальный анализ.

Ефимова М.А.: предоставление ресурсов.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.