Разработка и валидация тест-системы для диагностики дирофиляриоза у собак методом полимеразной цепной реакции

УДК 619:636:574/577
DOI 10.33861/2071-8020-2025-4-38-40

Оригинальное эмпирическое исследование

Миронова А. А., Василенко В. Н. Северо-Кавказский зональный научноисследовательский ветеринарный институт - филиал
Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный Ростовский
аграрный научный центр», Ростовская область, г. Новочеркасск
Миронова Л. П. Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего образования «Донской государственный
аграрный университет», Ростовская область, пос. Персиановский

Аннотация. Для диагностики дирофиляриоза в практике чаще всего используются методы микроскопического исследования крови, однако, из-за влияния на их точность множества субъективных факторов их относят к скрининговым. Экспресс-тесты IDEXX, позволяют выявить антиген D. immitis, но не выявляют антиген D. repens. Дальнейшее развитие диагностики в паразитологии основано на внедрении биотехнологий, в частности, метода полимеразной цепной реакции (далее, ПЦР), обладающего высокой специфичностью и чувствительностью, технической простотой, в связи с чем этот метод применим для рутинных диагностических исследований. Есть зарегистрированный под кодом 092 ПЦР-диагностикум, который применяется для выявления генетического материала D. immitis и D. repens, поэтому целью настоящего исследования явилась разработка прямого ускоренного метода выявления возбудителя заболевания в крови собак, обитающих на территории Ростовской области, которая достигнута путем разработки комплекта реагентов для проведения ПЦР-диагностики дирофиляриоза и сравнения эффективности разработанной тест-системы ПЦР с модифицированным методом Кнотта и иммунохроматографическим методом (экспресс-тесты IDEXX). В результате проведенных исследований установлено, что зараженность домашних собак дирофиляриозом в Новочеркасске - 10%, в Ростове-на-Дону - 3%, в г. Шахты - 3% и в г. Таганроге - 2%. Авторами предложено внедрение разработанной тест-системы для диагностики дирофиляриоза у собак методом ПЦР, обладающей высокой специфичностью, высокой чувствительностью и позволяющей выявлять возбудителя заболевания в течение 4-5 часов от начала исследования, в лабораторную практику ветеринарных клиник и лабораторий Ростовской области.

Ключевые слова: собаки, дирофиляриоз, диагностика, микроскопический метод, иммунохроматографический метод, полимеразная цепная реакция.

Нематоды семейства Filariidae, рода Dirofilaria являются возбудителями дирофиляриоза - паразитарного заболевания плотоядных животных и человека. У дефинитивных хозяев собак, кошек, лисиц и волков Dirofilaria immitis локализуется в сердце и легочной артерии, Dirofilaria repens - в подкожной соединительной ткани собак, лисиц и человека. Паразитирующие в полостях сердца D. immitis вызывают эндокардит, эмболию и тромбоз кровеносных сосудов, нарушение циркуляции крови, что в конечном итоге из-за расстройства сердечной деятельности приводит к гибели животных [4, 9]. Комары семейства Culicidae, родов Culex, Aedes, Anopheles являются промежуточными хозяевами обоих видов дирофилярий [3, 6]. Многочисленными исследованиями последних лет отмечена тенденция к широкому распространению дирофиляриозов и расширению их ареала. Из основных причин чаще всего называют климатические сдвиги в сторону потепления, неограниченные межрегиональные перемещения животных, ввоз зараженных особей из других стран, недостаточная инсектицидная деятельность в отношении комаров - промежуточных хозяев, а также недостаточный арсенал антгельминтиков против половозрелых дирофилярий [5]. При таком широком распространении инвазии одним из эффективных методов борьбы в системе лечебно-профилактических мероприятий является диагностика диро-филяриоза на ранних этапах развития болезни. Как правило, для визуального обнаружения микрофилярий используется микроскопическое исследование нативного мазка крови, а также модифицированный метод Кнотта [2, 8]. Однако, оба эти метода относятся к скрининговым и ни один из них не может исключать дирофиляриоз окончательно, так как эффективность результата зависит от интенсивности и продолжительности инвазии, времени суток, квалификации персонала и множества других факторов. Для видовой дифференциации используют специальные методы окраски микрофилярий, однако в силу сложности и трудоемкости эти методы неприменимы для рутинной диагностики.

Дальнейшее развитие диагностики в паразитологии основано на внедрении биотехнологий, в частности, метода ПЦР [4, 7]. Использование полимеразной цепной реакции позволяет устранить все недостатки применяющихся на сегодняшний день методик, поскольку обладает высокой специфичностью и чувствительностью, технической простотой, в связи с чем этот метод применим для рутинных диагностических исследований. Метод ПЦР настолько чувствителен и специфичен, что позволяет обнаружить молекулу искомой ДНК среди миллионов других молекул ДНК в исследуемом материале [1, 9]. Независимо от модификации метод ПЦР состоит из трех основных этапов: выделение ДНК, амплификация и детекция продукта ПЦР - амплифицированной ДНК [1, 10]. Актуальным является создание ПЦР-диагностикумов для выявления векторных паразитозов, в связи с чем целью настоящего исследования явилась разработка прямого ускоренного метода выявления возбудителя заболевания в крови собак, обитающих на территории Ростовской области, которая достигнута путем решения следующей задачи - разработать комплект реагентов для проведения ПЦР диагностики дирофиляриоза и сравнить эффективность стандартной ПЦР с модифицированным методом Кнотта и иммунохроматографическим методом (экспресс-тесты IDEXX).

Материалы и методы исследований. В качестве диагностического материала послужила кровь от 400 собак, владельцы которых обращались в ветеринарные клиники г. Ростова-на-Дону, Таганрога, Шахты и Новочеркасска по разным причинам. Исследования на дирофиляриоз проводилось тремя методами: усовершенствованным методом Кнотта, методом ПЦР и иммунохрома-тографическим методом (экспресс-тесты IDEXX).

Результаты исследований и их обсуждение. Исследования на дирофиляриоз модифицированным методом Кнотта показали наличие собак с микрофиляриемией. Наибольшая зараженность собак дирофиляриозом отмечалась в Новочеркасске - 10%; в Ростове-на-Дону - 3%; в г. Шахты - 3% и в г. Таганроге - 2%.

Разработка специфичных праймеров. Из баз данных NCBI GenBank получили нуклеотидные последовательности генов-мишеней для ПЦР. Анализ нуклеотидных полноразмерных геномов и участков различных генов филярий, взятых из базы данных GenBank (NCBI) последовательностей, проводили с применением пакета прикладных программ «BioEdit 6.0». В результате выравнивания нуклеотидных последовательностей COI-гена D. immitis и D. repens было выявлено несколько консервативных районов, которые и были избраны в качестве мишеней для отжига праймеров. Дизайн праймеров, комплементарных данному участку формировали так, чтобы терминальные или субтерминальные нуклеотидные остатки были комплементарны родоспецифичным остаткам в последовательностях COI и содержали гуанин или цитозин. Уникальность ПЦР-прай-меров проверялась посредством поиска их последовательностей в базе данных GenBank при помощи алгоритма BlastN. Олигонуклеотиды были синтезированы амидофосфитным методом и очищены при помощи препаративного электрофореза в ПААГ.

Выделение ДНК из образцов крови производили набором «ДНК-Сорб B» (ФГУ ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г. Москва) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Метод выделения основан на специфической обратимой сорбции ДНК в присутствии хаотропных солей (гуанидинтиоцианат, гуанидинхлорид, NaI, и т.д.) на частицы силикагеля.

Проведение амплификации. Рассчитанные видоспецифичные праймеры для выявления ДНК имели температуру отжига 66°С. ПЦР проводили в реакционной смеси стандартного состава с использованием 10 пкМ каждого праймера, 10 мкл раствора ДНК с добавлением 3 мМ MgCl2 Амплификация проводилась на программируемом термостате «Терцик» (ЗАО «ДНК-технология», Москва) в следующем режиме: предварительная денатурация при 95°С проходила в течение 5 минут, затем осуществлялись 35 циклов, включающих этапы: 1) денатурация при 95°С - 15 секунд; 2) отжиг праймеров при 60°С - 20 секунд; 3) элонгация при 72°С - 25 секунд.

Положительным контролем служила ДНК, выделенная из взрослых особей D. immitis и D. repens. Все позитивные пробы крови были исследованы методом ПЦР с видоспецифичными праймерами к D. immitis, в результате чего было установлено присутствие генетического материала этого гельминта у 88,9% собак с микрофиляриемий (16 из 18 собак). Исследование данных проб крови в ПЦР с видоспецифичными праймерами к D. repens подтвердило наличие у остальных собак «кожной» формы дирофиляриоза. Визуализацию полученных ампликонов проводили методом электрофореза в 2 %-ном агарозном геле.

Исследование дирофиляриоза иммунохроматографическим методом (экспресс тесты IDEXX), позволяющим выявить антиген D. immitis в стабилизированной крови или сыворотке крови собак. Полученные результаты оказались в 100 % случаев сопоставимы со стандартным вариантом ПЦР. Использование метода ПЦР-диагностики без использования дорогостоящих амплифика-торов позволяет внедрить его в диагностическую практику ветеринарных клиник, лабораторий, школ собаководства и других учреждений специального назначения.

Клиническое испытание разработанной тест-системы. Мы провели исследования образцов крови собак со следующими клиническими признаками: одышка, быстрая утомляемость, кашель, жесткое дыхание, систолические шумы сердца, увеличение размеров сердца, цианоз слизистых оболочек, уплотнения на коже, кожные поражения, с территорий г. Ростова-на-Дону, г. Таганрога и г. Шахты.

По данным таблицы 1 при исследовании 168 образцов крови в 18,8% случаях был подтвержден диагноз дирофиляриоз, в том числе, по Ростову 15 положительных проб из 67 (20,4%), в Таганроге - 2 из 10 (20%) и в городе Шахты - 9 из 61 (14,8%).

Таблица 1 Результаты исследований крови собак на наличие генетического материала возбудителей дирофиляриоза

При выявлении в 20 образцах крови D. immitis положительный результат был получен в двух случаях - 10% (табл. 2); D. repens по­ложительными оказались 5 из 14 образцов - 35,7% (табл. 3).

Таблица 2 Результаты исследования образцов крови собак на наличие генетического материала Dirofilaria immitis

Таблица 3 Результаты исследования образцов крови собак на наличие генетического материала Dirofilaria repens

Заключение. Зараженность домашних собак D.immitis и D.repens дирофиляриозом установлена в Новочеркасске -10%, в Ростове-на-Дону - 3%, г. Шахты - 3% и г. Таганроге - 2%. В лабораторную практику ветеринарных клиник и лабораторий Ростовской области может быть внедрена разработанная нами тест-система для диагностики дирофиляри-оза у собак методом полимеразной цепной реакции, обладающая высокой специфичностью, высокой чувствительностью и позволяющая выявлять возбудителя заболевания в течение 4-5 часов от начала исследования.

Список литературы:

1. Жуков В. М. Патоморфология дирофиляриозной инвазии. Ветеринария. 2011; (7): 31-32.

2. Зорина В. В. Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР): методическое пособие. ДНК-технология. 2012: 80.

3. Колодий И. В., Ермаков А. М., Карташев В. В., Карташев С. Н. Распространение трансмиссивных заболеваний собак в аспекте глобального потепления. Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. 2012; (1): 74-76.

4. Морозов Е. Н., Кузнецова К. Ю. Молекулярная диагностика паразитарных болезней. Инфекционные болезни. 2014; (1): 36-38.

5. Пономарев А. А., Василевич Ф. И. Кровососущие насекомые как фактор передачи инфекционных и инвазионных болезней животных. Актуальные вопросы ветеринарной медицины. 184.

6. Сергеев В. П., Супряга В. Г., Дарченкова Н. Н., Жукова Л. А., Иванова Т. Н. Дирофиляриоз человека в России. Российский паразитологический журнал. 2012; (4): 60-64.

7. Сергиев В. П. Молекулярная паразитология: подходы и перспективы. Молекулярная медицина. 2008; (3): 15-21.

8. Сухова М. В. Эпизоотологический надзор при дирофиляриозе плотоядных в условиях Среднего и Нижнего Поволжья: автореф. дис. ... канд. вет. наук: 16.00.03, 03.00.19. Нижний Новгород. 2002: 22 с.

9. Bell A. S., Ranford-Cartwright L. C. Real-time quantitative PCR in parasitology. Trends Parasitol. 2002; (18 (8): 337-342.

10. Bretagne S. Molecular diagnostics in clinical parasitology and mycology: limits of the current polymerase chain reaction assays and interest of the real-time PCR assays. Clin. Microbiol. Infect. 2003; (9 (6): 505-511.

Сведения об авторах:

Василенко Вячеслав Николаевич, доктор сельскохозяйственных наук, член-корреспондент РАН, главный научный сотрудник Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института - филиала ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0.

Миронова Людмила Павловна, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры терапии и пропедевтики ФГБОУ ВО «Донской государственный аграрный университет»; 346493, Ростовская область, Октябрьский район, поселок Персиановский, ул. Кривошлыкова, 24; e-mail: mironova_lp@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Миронова Анна Анатольевна, доктор ветеринарных наук, главный научный сотрудник творческого коллектива по изучению инвазионных заболеваний животных Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института - филиалf ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0; тел.: 8-903-4718275; e-mail: aa_mironova@mail.ru.

Заявленный вклад авторов: рукопись была написана благодаря вкладу всех авторов. Все авторы одобрили окончательную версию рукописи.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.