УДК: 579.841.93
DOI 10.33861/2071-8020-2025-5-23-25
Оригинальное эмпирическое исследование
Роенко А. Д., Пименов Н. В. Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования
«Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии – МВА имени К.И. Скрябина», г. Москва
Аннотация. Бруцеллёз – социально значимая зоонозная инфекция, поражающая сельскохозяйственных животных и передающаяся людям через продукты животного происхождения, полученных от заражённых животных. Бруцеллёз широко распространён на всей территории стран СНГ. Основным средством борьбы с бруцеллёзом является вакцинопрофилактика. В Российской Федерации для профилактики бруцеллёзной инфекциеи в основном используются вакцины, представленные S-формами бруцелл. Однако в последнее время также набирают популярность вакцины, представленные только R-формами. Преимуществами таких вакцин являются возможность дифференциации заражённых животных от вакцинированных, и то, что такие вакцины обладают меньшей остаточной вирулет-ностью, что позволяет вакцинировать животных в том числе в неблагополучных по бруцеллёзу хозяйствах, без риска вспышки заболевания. Для контроля качества готовых вакцинопрепаратов используются питательные среды определённого состава. По количеству выросших на чашках с питательной средой колоний определяется количество доз во флаконе вакцины. В Российской Федерации существует необходимость в импортозамещении таких сред. Однако при подборе отечественной питательной среды для контроля качества необходимо чтобы она обеспечивала стабильные показатели роста микроорганизмов, не уступая в этом отношении импортным аналогам. Препараты, изготовленные из R-форм бруцелл, обладают большей чувствительностью к параметрам культивирования, в том числе к составу агаров для контроля качества бруцеллёзных вакцинопрепаратов. Поэтому в нашей работе для сравнительной оценки ростовых свойств питательных сред отечественного и импортного производства мы использовали штамм Brucella abortus РБ-51 «ЩБК», представленный только стабильными R-формами.
Ключевые слова: вакцины, иммунопрофилактика, импортозамещение, бруцеллёз, контроль качества, питательные среды, Brucella abortus, бруцеллагар, ростовые свойства.
На данный момент в Российской Федерации на рынке вакцин против бруцеллёза крупного рогатого скота основными представленными препаратами являются живые вакцины из штаммов Brucella abortus 19, Brucella abortus 82, Brucella abortus 75/79 и Brucella abortus РБ-51 «ЩБК» [6, 7]. Все вышеуказанные препараты производятся и контролируются на Щёлковском биокомбинате. Все штаммы обладают различными ростовыми свойствами, поскольку предствлены разными формами бруцелл. Так, например 19 штамм представлен только S-формами, 82, 75/79 штаммы SR- и RS-формами, а РБ-51 только R-формами [8].
Существенным недостатком вакцин из штаммов Brucella abortus 19, 82 и 75/79, представленных на рынке Российской Федерации, является наличие в крови вакцинированных животных антител к S-формам бруцелл – таких же, как и у истинно больных животных. Эти антитела обнаруживаются у животных при исследовании сыворотки крови в результате чего невозможно точно сказать вызвана ли положительная реакция вакциной или же животное заражено патогенными бруцеллами. Вакцина из штамма Brucella abortus РБ-51 «ЩБК» решает эту проблему штамм РБ-51 «ЩБК» представлен только стабильными R-формами. При введении вакцины антитела к S-антигену в крови животного не образуются, а, значит, в случае положительной реакции РА, РСК или ИФА можно однозначно сказать, что животное заражено патогенными бруцеллами [9].
Поэтому спрос на вакцину именно из этого штамма постоянно повышается. Тем не менее, штамм РБ-51 «ЩБК» куда более требователен к параметрам культивирования и качеству питательных сред по сравнению со своими аналогами, ввиду своей меньшей вирулентности. Исходя из этого, исследование на оценку ростовых свойств питательных сред для контроля качества готовых вакцин мы решили проводить, используя именно этот штамм, так как даже незначительное несоответствие состава питательной среды вызвало бы значительную разницу в количестве выросших колоний микроорганизмов на чашках Петри.
В связи с текущей ситуацией в мире остро встаёт вопрос об импортозамещении в том числе и в биологической промышленности, в частности питательных сред и их компонентов. В нашем исследовании мы провели сравнительную оценку ростовых свойств сред импортного производства «Condalab» и отечественного «Бруцелла-ГРМ Агар» с целью обоснования отказа от питательных сред импортного производства в рамках контроля готовых вакцинопрепаратов.
Целью работы является сравнительная оценка ростовых свойств двух питательных сред бруцеллагаров импортного и отечественного производства. Для возможности последующего им-портозамещения питательных сред в рамках контроля качества готовых вакцинопрепаратов.
Материалы и методы исследований. Для оценки ростовых свойств были выбраны две питательные среды: питательная среда «Condalab» производства Laboratorias Conda S.A. Мадрид, Испания, состава: 15% бактериологический агар, 10% казеиновый пептон, 1% декстроза, 10% мясной пептон, 0,1% бисульфит натрия, 5% хлорид натрия, 2% дрожжевой экстракт; и питательная среда «Бруцелла-ГРМ Агар» производства ФБУН Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии, посёлок Оболенск Московская область, Российская Федерация состава: 7,5% панкреатический гидролизат рыбной муки сухой, 7,5% пептон мясной, 10% панкреатический гидролизат казеина сухой, 5% стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, 3% дрожжевой экстракт, 2% Д-глюкоза, 3,5% натрий хлористый, 0,005% тиамина гидрохлорид, 0,01% meso-Erythritol, 0,1% натрий пиросернистокислый (натрия метабисульфит), 10% +-3 агар бактериологический. На питательных средах в чашках Петри культивировали второй пассаж штамма Brucella abortus РБ-51 «ЩБК» в разведениях 10-7 (3 чашки каждой среды) и 10-8 (5 чашек каждой среды) в течение 4 суток.
Результаты исследований и их обсуждение. Из исходного штамма Brucella abortus РБ-51 «ЩБК» на пробирках со скошенным Мартеновским агаром были получены колонии второго пассажа. Колонии смывали во флакон физиологическим раствором и получили оптическую концентрацию в 10 миллиардов бактериальных клеток на миллилитр по стандарту мутности Л.А. Тарасевича. В связи с такой концентрацией приняли решение проводить посев на питательные среды в разведениях 1:10-7 (3 чашки) и
1:10-8 (5 чашек) на чашках Петри. Чашки выдерживали в термостате при 37 градусах в течение 3-х суток. В результате проведённых исследований на всех чашках наблюдали чистый рост колоний бруцелл в количестве приведённом в таблице 1.
Таблица 1 Количество колоний бруцелл штамма РБ-51 «ЩБК» на исследуемых средах
| Наименование питательной среды | Разведение | Количество выросших колоний бруцелл | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Condalab | 10-7 | 174 | 157 | 166 | - | - |
| 10-8 | 20 | 16 | 18 | 18 | 13 | |
| Бруцелла-ГРМ агар | 10-7 | 176 | 162 | 179 | - | - |
| 10-8 | 23 | 28 | 19 | 28 | 23 | |
Биологическую концентрацию определяли исходя из ОФС.1.7.2.0008.15 «Определение концентрации микробных клеток» по формуле:
где: c – сумма подсчитанных колоний на всех чашках; n1 – количество чашек первого разведения; n2 – количество чашек второго разведения; d – коэффициент первого разведения; a – количество посевного материала в мл равное 0,1. Показатель 0,1 – коэффициент, учитывающий кратность первого и второго разведений.
Таким образом, получили для бруцеллагара «Condalab» N = 16,6?109 КОЕ/мл, а для «Бруцелла-ГРМ Агара» N = 18,2?109КОЕ/мл.
Для подтверждения результатов был проведён повторный эксперимент с готовыми вакцинами из 19 и 82 штамма. Аналогичным образом определили оптическую концентрацию микроорганизмов в каждом флаконе для каждого штамма. Она составила 215 миллиардов на миллилитр для штамма 19, и 223 миллиарда на миллилитр для штамма 82. Согласно СТО ФКП «Щёлковский биокомбинат» на соответствующие вакцины посев на чашки Петри проводили из разведений 1:10-8 (3 чашки) и 1:10-9 (5 чашек). Чашки аналогично выдерживали при 37 градусах трое суток. В результате на чашках наблюдался чистый рост колоний бруцелл в количестве, представленном в таблице 2.
Таблица 2 Количество колоний бруцелл штаммов 19 и 82 на исследуемых средах
| Наименование питательной среды | Разведение | Количество выросших колоний бруцелл | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Condalab Brucella | 10-8 | 256 | 257 | 260 | - | - |
| 10-9 | 21 | 22 | 27 | 23 | 21 | |
| Бруцелла-ГРМ агар | 10-8 | 284 | 265 | 273 | - | - |
| 10-9 | 29 | 42 | 25 | 41 | 25 | |
| Condalab | 10-8 | 286 | 295 | 278 | - | - |
| 10-9 | 26 | 29 | 29 | 25 | 23 | |
| Бруцелла-ГРМ агар | 10-8 | 254 | 295 | 270 | - | - |
| 10-9 | 22 | 43 | 22 | 23 | 38 | |
Следовательно, из расчётов по той же формуле биологическая концентрация микроорганизмов в 1 мл вакцины составит:
Для штамма Brucella abortus 19 на агаре «Condalab» N = 283х10*9 КОЕ/мл, на агаре «Бруцелла-ГРМ Агар» N = 276х10*9 КОЕ/мл.
Для штамма Brucella abortus 82 на агаре «Condalab» N = 253х10*9 КОЕ/мл, на агаре «Бруцелла-ГРМ Агар» N = 281х10*9 КОЕ/мл.
В результате проведенных исследований установлено, что ростовые свойства обоих сред отечественного и импортного производства соответствуют необходимым для роста культур бактерий Brucella abortus. И могут быть использованы для контроля качества вакцин против бруцеллёза крупного рогатого скота. Из полученных результатов так же видно, что разница между количеством выросших колоний микроорганизмов более заметна при посеве менее вирулентных штаммов РБ-51 «ЩБК» и Brucella abortus 82, и в этом случае импортный агар уступает отечественному.
Заключение. Несмотря на то, что как отечественная, так и импортная среды прошли контроль качества по ростовым свойствам, установлено что среда отечественного производства обладает более оптимальным составом и даёт больший рост бактериальных клеток для менее вирулентных штаммов. Поскольку штамм Brucella abortus РБ-51 «ЩБК» является наиболее чувствительным к условиям культивирования по сравнению с прочими штаммами, исходя из полученных данных, можно заключить, что в рамках программы импортозамещения имеются все основания для перехода на исключительно отечественные среды бру-целлагара для контроля качества бруцеллёзных вакцин.
Список литературы:
1. Игнатов П. Е. Диалоги о коварном бруцеллёзе. 2010; 102 с.
2. Вершилова П. А., Чернишева М. И., Князева Э. Н. Патогенез и иммунология бруцеллеза: экспериментальные данные. Медицина. 1974.
3. Бондарев Е. Г. Сравнительное изучение диагностической эффективности О-ПС антигенов, изготовленных из штаммов различных видов бруцелл, в РИД при бруцеллезе животных. 2017. 139 с.
4. Алимов A. M., Габидуллин Р. Г., Сазонова Т. Я. Получение и изучение антигенных и иммуногенных свойств ЛБК-комплекса бруцелл. Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции, цосвящённой 30-летию института «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов». 2000: 249-250.
5. Шумилов К. В. [и др.]. Вакцины против бруцеллеза крупного рогатого скота. Ветеринария. 1984; (12): 26.
6. Роенко А. Д., Пименов Н. В. Обзор противобруцеллёзных вакцинопрепаратов. Аграрная наука в обеспечении продовольственной безопасности и развитии сельских территорий: Сборник материалов IV международной научно-практической конференции. ГОУ ВО ЛНР ЛГАУ. 2023: 335-336.
7. Слепцов Е. С. [и др.]. Иммунопрофилактика бруцеллеза животных с использованием вакцин из штаммов Brucella abortus 19, 104M, 82 и Brucella suis 61. 1999.
8. Паспорт штамма Brucella Abortus РБ-51 «ЩБК». ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации. 2016.
9. Роенко А. Д., Пименов Н. В., Голдина В. Ф. Сравнительная эффективность биосинтеза в зависимости от содержания аминного азота в питательной среде при производстве вакцины против бруцеллёза крупного рогатого скота из штамма Brucella abortus РБ-51 «ЩБК». Вакцины нового поколения для профилактики особо опасных болезней сельскохозяйственных животных. Сельскохозяйственные технологии. 2023: 180-184.
Сведения об авторах:
Пименов Николай Васильевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой иммунологии и биотехнологии ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И. Скрябина; 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23; e-mail: pimenov-nikolai@yandex.ru.
Ответственный за переписку с редакцией: Роенко Андрей Дмитриевич, аспирант кафедры иммунологии и биотехнологии ФГБОУ ВО МГАВ-МиБ – МВА имени К.И. Скрябина; 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23; тел.: 8-916-2315723; e-mail: rond900@gmail.com.
Заявленный вклад авторов: рукопись была написана благодаря вкладу всех авторов. Все авторы одобрили окончательную версию рукописи.
Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
http://www.vetkuban.com/num5_202506.html