К вопросу выделения чистой культуры возбудителя пастереллёза pasteurella multocida

УДК 619:616:981.45:636.5:616.084
DOI 10.33861/2071-8020-2021-5-30-32

Каширин В.В. Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт - филиал
Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный Ростовский аграрный
научный центр», Ростовская область, г. Новочеркасск

Пастереллёз («куриная холера», геморрагическая септицемия млекопитающих) вызывает бактерия Pasteurella multocida, способная многих и много (multi) убить (cid), представленная С.Т. Rosenbusch и I.A. Merchant (1939) типовым видом рода Pasteurella [5, 6, 9, 35]. Её первая в бактериологии культура на искусственной среде (в бульоне) выделена из трупов кур при изучении «куриной холеры» Л. Пастером (1880) [33]. С тех пор культурой бактериальной называют популяцию жизнеспособных бактерий, выращенных на питательной среде, а прямое выделение её из трупов (из патологического материала) применяют как основной способ бактериологического исследования [4, 6]. Наиболее чаще его используют в целях диагностики и таксономии. Идентификация и дифференциация бактерий могут быть проведены только при наличии их чистых культур [6]. Поэтому в случаях получения смешанной культуры микроорганизмов, ей инфицируют восприимчивый организм и затем прямым выделением из трупа получают чистую культуру возбудителя болезни [2]. В пассаже через восприимчивый организм с последующим тем же способом прямого выделения из трупа чистой культуры восстанавливают штаммы бактерий при поддержании в коллекции, при изготовлении и контроле биопрепаратов. Ему дополнением служит дробный посев исследуемого патологического материала на плотной питательной среде с последующим пересевом характерно растущей колонии бактерий (в частности, P. multocida) в питательный бульон и получением их чистой культуры [2]. Однако в этом случае чистая культура бактерий уже второй генерации на питательной среде после их размножения in vivo, несколько отличающаяся от исходной (первой) морфологией роста, то есть доступным наблюдению признаком явления диссоциации. По определению микробиологии, диссоциация (разъединение) -появление в популяции бактерий особей, отличающихся от исходного типа внешним видом и структурой колоний, а также наследственно закреплёнными изменениями некоторых морфологических и биологических свойств [6]. Данные многих исследователей, в том числе и наши, показывают, что важным фактором вирулентности P. multocida служит капсула [2, 9, 15, 32]. Утрата или же восстановление капсулы и, как правило, вирулентности P. multocida сопровождаются изменением морфологии её колоний, которые могут иметь гладкую радужную или не радужную (S-), слизистую или мукоидную (М-), шероховатую (R-) формы и SR- и RS-переходные формы [2, 9, 10, 11, 30, 31]. Однако это характеризует изменчивость P. multocida, но не раскрывает условия её диссоциации. По этой причине не представляется возможным обеспечить единство методологии выделения чистой культуры P. multocida и достоверность оценки морфологических и биологических свойств бактерии. В этом заключается основной недостаток традиционного способа.

Согласно принятому в микробиологии определению, чистая культура бактерий, выделенная из какого-либо источника в определённое время, называется штаммом [4, 6]. Также известно, что стабильность патогенных свойств микроорганизмов - важнейший показатель при их использовании [7, 22, 28]. Однако в научных и практических целях выделяемые и применяемые штаммы P. multocida часто не отвечают этим критериям, а существующая методология не обеспечивает их восстановление в пассаже через восприимчивый организм. Исходя из этого, исторически сложившийся традиционный способ выделения чистой культуры (штамма) возбудителя пастереллёза Pasteurella multocida из какого-либо источника в определенное время взят за прототип [4, 6]. За показатель «источник» принимают, как правило, заражённый организм или труп погибшего в заражении организма определённого вида и возраста. Показатель «определённое время» подробно не раскрыт и вероятнее всего указывает на дату выделения чистой культуры P. multocida. Её же по-прежнему эмпирически выделяют от павших и вынужденно убитых больных, произвольно доставленных из эпизоотических очагов или воспроизведённых в экспериментальном заражении. Выделенные из одного и того же источника (трупа) культуры P. multocida нередко отличаются по морфологии роста, в частности - по форме колоний (то есть доступным наблюдению признаком явления диссоциации), по формообразованию и форме микробной клетки, а также по вирулентности. Адаптация и изменчивость пастерелл в изменяющихся условиях трупа с момента смерти не учитываются. Ввиду этого срок (своевременность) выделения чистой культуры (штамма) P. multocida и ряд других принципиально важных условий методически не предусмотрены. Однако от этого зависит типичность её свойств и, как следствие, достоверность результата исследования. Очевидно, что традиционный способ (прототип) не обеспечивает условия выделения чистой культуры возбудителя пастереллёза P. multocida строгой типичности морфологических и биологических свойств.

Несмотря на диссеминацию (генерализацию) клеток P. multocida током крови по всему организму, её чистую культуру выделяют произвольно в большом объёме посева проб патологического материала (разных органов, тканей) [1, 2, 3]. Такой подход влечёт необоснованные затраты материальных средств и рабочего время, тогда как выделение чистой культуры P. multocida и наличие типичности её свойств не во всех случаях исследования возможны. Нередко при культивировании посевов на плотной питательной среде нет роста культуры бактерий, а в питательном бульоне получают нетипичной морфологии «интенсивный» рост культуры. И в первом случае создается мнение о стерильности патологического материала, а во втором - подозрение на получение смешанной культуры, что соответственно влечёт дополнительные манипуляции в исследованиях. Вызывают вопрос и случаи, когда культура P. multocida, выделенная при явно остром течении пастереллёза, в биологической пробе не проявляет патогенность. По этим причинам на бактериологическое исследование затрачивают до 10 суток или даже экспертизу повторяют на вновь доставленном материале. Чтобы оптимизировать условия выделения чистой культуры возбудителя пастереллёза применяют разные обогащённые питательные среды, обычно тоже эмпирически подобранные. Однако P. multocida легко даёт рост даже на обычной простой плотной и жидкой питательной среде для культивирования микроорганизмов, в частности, имеющей Технические условия (ТУ-9398-020-78095326-2006, ТУ-9398-021-78095326-2006, рН 7,2-7,4). Тем не менее, изменчивость бактерии обусловлена влиянием условий окружающей среды. Первые попытки сохранить возбудителя «куриной холеры» (P. multocida) in vitro предпринял Л. Пастер [33]. Лишённая контакта с атмосферным кислородом культура не потеряла вирулентности, а оставленная в обычных условиях её утратила. Аналогично, выращенные и хранящиеся в 1%-ной пептонной воде под вазелиновым маслом культуры P. multocida продолжительно сохраняют биологические свойства, на что не влияет содержание в среде сыворотки крови разных видов животных [26]. Однако, P. multocida - не только аэроб, но и факультативный анаэроб. Её обмен веществ и энергии, ослабление вирулентных и других свойств в отсутствии свободного кислорода и при использовании атомарного лишь замедляются.

Имеются сведения о том, что «носители» P. multocida - потенциальный источник инфекции [3, 18, 20, 21, 29]. Бактерия локализуется, переживает, колонизирует и проявляет инвазивность на слизистых оболочках полости носа, рта, глотки [6, 18, 19, 34]. Однако её избирательность паразитирования в этой области не раскрыта. Кроме того, заболевание пастереллёзом регистрируется в регионах с тёплым и умеренным климатом, возникает неожиданно (в виде «молниеносного» течения или внезапной «взрывной вспышки») при ослаблении естественных защитных сил организма под влиянием неблагоприятных факторов внешней среды, особенно резких колебаний температуры и дождей [3, 6, 8, 9, 27]. Однако традиционные представления о природе активизации и о происхождении инфекции носят гипотетический характер, так как механизм повышения вирулентности Р. multocida и заражения восприимчивых организмов естественным путём экспериментально не воспроизведён и, поэтому, не установлен.

По нашим наблюдениям заболевание действительно часто и внезапно возникает при резких колебаниях температуры и дождливой погоде, характеризуясь, как правило, сверхострым течением в начале эпизоотии [15]. Смерть наступает так быстро, что классические патологоанатомические изменения, кроме геморрагий, не успевают развиться. Первые погибшие наиболее упитанные и крепкие на вид особи, поэтому всякие предположения об ослаблении естественных защитных сил организма как условия возникновения пастереллёза исключаются. Не находят объяснения случаи быстрого угасания эпизоотии, когда без видимых причин число погибших за сутки значительно уменьшается, а динамика снижения падежа выглядит волнообразной. Гибель в очаге резко прекращается и на слизистых оболочках верхних дыхательных путей и глотки остаются потенциально патогенные пас-тереллы («здоровое носительство»). Однако эпизоотическая ситуация становится чрезвычайно опасной, а течение болезни сверхострым, если распространение инфекции и заражение происходят через воду. При проведении опытов нами отмечена зависимость морфологических и биологических свойств P. multocida от пути заражения организма, инфицирующего материала, температуры и жидкой фазы окружающей среды [12, 13, 24, 25]. В динамике размножения P. multocida в крови заражённых и погибших, а также в пробах крови, на жидкой и плотной питательной среде изучен морфогенез (формообразование), в т. ч. формирование капсулы и биполярности [12, 14, 16, 23]. Это позволило впервые установить функциональную морфо- и термолабильность P. multocida, объяснить условия вирулентности и диссоциации бактерии, раскрыть природный механизм пастереллёза [11, 14, 15, 17, 24]. P. multocida выделяет экзометаболит. Из него при снижении температуры формируется капсула и, соответственно, повышается вирулентность бактерии. Изолированная в стерильной (чистой) воде бактерия сохраняет, а при контакте с питательной средой быстро утрачивает капсулу и вирулентность. Температура, как фактор воздействия на формирующуюся и сформированную капсулу P. multocida, предопределяет возможность проявления бактерией патогенных свойств и обусловливает закономерность возникновения пастереллёза в периоды резких колебаний температуры и выпадения дождей. Внезапное появление и неожиданное угасание эпизоотий пастереллёза - результат прямо противоположного резкого влияния низкой, умеренной и повышенной температуры окружающей среды на капсулу и патогенные свойства Р. multocida. Слизистые оболочки носовой, ротовой и глоточной полостей - природная область естественного носительства P. multocida (локализации, длительного переживания, колонизации и инвазивности), где бактерии свойственна функциональная морфо- и термолабильность в зависимости от температуры окружающей среды (в основном воздуха и питьевой воды). Именно здесь взаимодействие P. multocida и восприимчивого организма при ключевой роли температурного фактора определяет возможность начала воспалительного процесса (первичный аффект) и представляет собой естественный путь (механизм) заражения пастереллёзом [15, 24]. С раскрытием природных условий развития пастереллёза окончательно определены недостатки традиционного способа и основополагающие отличительные признаки нового решения на способ выделения чистой культуры (штамма) возбудителя пастереллёза P. multocida.

Ввиду функциональной морфо- и термолабильности Р. multocida, принципиальное значение в выделении и оценке её чистой культуры (штамма) представляют: путь заражения, масса тела восприимчивого организма, инфицирующий материал, температура окружающей среды (при заражении организма и при остывании трупа соответственно), время вскрытия трупа после смерти организма, глубина точки отбора инфекционного материала из трупа для бактериологического исследования.

Заключение. Для обеспечения единства условий методологии выделения, оценки и применения чистой культуры (штамма) возбудителя пастереллёза Р. multocida разработан и предлагается для лабораторной практики способ (стандарт). Способ, включающий получение первой генерации микроорганизма на искусственной среде, отличается тем, что зараженную естественным путём или интраназально, или орально на слизистую оболочку носовой, ротовой, глоточной полостей и павшую от пастереллёза особь, выбранную из птицы или кролика, массой тела 350 г через 3 ч (при 20±1°С остывания трупа) вскрывают, берут пробу крови из сердца и вносят в стерильную воду при температуре 20±1°С в соотношении 1:9 по объёму, осадок встряхивают и переводят во взвесь, затем центрифугируют при 1500 об/мин 5 мин; надосадочную жидкость как изолят пастерелл из крови в разведении 10-1 разводят до 10-2, 10-3 и высевают при температуре 20±1°С на питательный бульон и питательный агар, посевы культивируют 9-19 ч при 37°С и 1 ч при 20°С. Полученную культуру оценивают чистой по строго типичной морфологии сплошного роста и однотипным колониям S-формы, по идентичным кокко- и диплококкоподобным капсулированным клеткам в полях зрения микроскопа, а также высокой вирулентности для восприимчивых лабораторных животных и птиц и с характерно выраженным свойством микробного антагонизма.

Список литературы:

1. Бакулин В.А. Болезни птиц// 2006. С. 256, 270.
2. Борисенкова А.Н. Профилактика пастереллёза птиц// Россельхозиздат. 1979. С. 4-5, 41-44.
3. Буткин Е.И. Пастереллёз (холера) птиц// Колос. 1972. С. 48, 50, 61-66, 92-97.
4. Ветеринарная энциклопедия// 1972. Т. 3. С. 773.
5. Ветеринарная энциклопедия// 1973. Т. 4. С. 836-837.
6. Ветеринарный энциклопедический словарь// 1981. С. 50, 160, 257, 378-379.
7. Григорьева Г.И., Игнатов П.Е. Факторы патогенности как протективные антигены при конструировании вакцин// Сельскохозяйственная биология. 1987. № 12. С. 100-104.
8. Дейчман A.M. Природа происхождения и активизации инфекций// Энвай-ронментальная эпидемиология. 2011. № 5. С. 813.
9. Домарадский И.В. Возбудители пастереллёзов и близких к ним заболеваний. Медицина. 1971. С. 15-18, 32-33, 41, 46, 230.
10. Каширин В.В. Характеристика птичьих штаммов Pasteurella multocida по капсульному антигену и патогенности// Сборник научных трудов ВГНКИ. 1985. С. 96-99.
11. Каширин В.В. Характеристика птичьих штаммов Pasteurella multocida по морфологии и вирулентности// Известия Северо-Кавказского научного центра высшей школы. Естественные науки. 1989. № 3. С. 109-115.
12. Каширин В.В. Объяснение феномена биполярности бактерий Pasteurella multocida// Доклады Россельхозакадемии. 1996. № 5. С. 32-35.
13. Каширин В.В. Биологический принцип стандартизации штаммов бактерий возбудителя пастереллёза птиц// «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов». Тезисы докладов Всероссийской научной конференции. 2001. С. 57-58.
14. Каширин В.В. Морфогенез бактерий Pasteurella multocida, патогенных для птиц// Ветеринария. 2012. № 8. С. 26-30.
15. Каширин В.В. Влияние температуры на патогенность Pasteurella multocida - природный механизм пастереллёза// Ветеринария. 2014. № 3. С. 28-32.
16. Каширин В.В. Методология выявления Pasteurella multocida в крови зараженных и погибших птиц// Ветеринарная патология. 2015. № 3. С. 43-49.
17. Каширин В.В. Восстановление и биологическая изоляция патогенных штаммов Pasteurella multocida от птиц к моменту использования. Ветеринария. 2016. 11. С. 24-29.
18. Кожевников Е.М. Локализация P. multocida в организме птиц-пастерел-лоносителей// Ветеринария. 1971. № 2. С. 106-107.
19. Кожевников Е.М. Локализация P. multocida в организме птиц// Ветеринария. 1974. № 1. С. 59-61.
20. Коркишко В.П. Роль пастереллоносительства в эпизоотологии холеры птиц// Сб. работ СКЗНИВИ. 1968. Вып. 14. С. 35-42.
21. Луницин В.Г. Пастереллоносительство у пантовых оленей, некоторых видов грызунов и птиц в горном Алтае// Научн. тр. НИИ пушного звероводства и кролиководства. Пантовое оленеводство. 1984. Т. 30. С. 160-168.
22. Панин А.Н., Татаринцев Н.Т. Основные требования к производственным и контрольным штаммам микроорганизмов// Ветеринария. 1993. № 4. С. 28-29.
23. Каширин В.В. Способ выявления бактерий Pasteurella multocida при пастереллёзном процессе у птиц// Патент РФ № 2051970. 1996.
24. Каширин В.В. Способ повышения вирулентности бактерий Pasteurella multocida// Патент РФ № 2123531. 1998.
25. Каширин В.В. Способ биологический изоляции патогенных пастерелл для сохранения к моменту использования// Патент РФ № 2286391. 2006.
26. Писковой Ф.Р., Кравченко З.Н. Сохранность птичьих пастерелл на жидких средах под вазелиновым маслом// Тр. Краснодарской НИВС. 1965. Т. 3. С. 219-220.
27. Пустовит Г.Л. Геоклиматические факторы и пастереллез птиц// Птицеводство. 1965. № 12. С. 22-24.
28. Селиванов А.В., Кириллов Л.В., Борисович Ю.Ф. Требования к штаммам микроорганизмов для изготовления биопрепаратов// Ветеринария. 1980. № 4. С. 33-35.
29. Сердюк Н.Г., Цимох П.Ф. Роль свободноживущих птиц и грызунов в распространении пастереллёза// Ветеринария. 1970. № 6. С. 53-54.
30. Carter G.R., Rigland С.Н. Dissociation and virulence in strains of Pasteurella multocida isolated from a variety of lesions// Canad. J. Comp. Med. Vet. Sci. 1953. Vol. 17. P. 473-479.
31. Carter. G.R. Studies on Pasteurella multocida. Identification of antigenic characteristics and colonial variants// Amer. J. Vet. Res. 1957. Vol. 18. N 66. P. 210-213.
32. Namioka S., Murata M. Serological studies on P. multocida. Characteristics of somatic (O) antigen of the organism// Cornell Vet. 1961. Vol. 51. 4. P. 507-521.
33. Pasteur L. De L'attenuation du virus de cholera des poles// C.R. Acad. Sci. 1880. 91. P. 637-680.
34. Rhoades K.R., Rimler R.B. Pasteurella multocida Colonization and Invasion in Experimentally Exposed Turkey Poults// Avian Diseases. 1990. Vol. 34. P. 381383.
35. Rosenbusch C.T., Merchant I.A. A study of the haemorrhagic septicaemia Pasteurella// J. Bacteriology. 1939. Vol. 37. 1. P. 69-89, 232-234, 925-936.

Резюме. В статье представлен аналитический обзор о выделении чистой культуры возбудителя пастереллёза P. multocida по литературным данным и результатам собственных исследований. На основе новых знаний в этиологии пастереллёза выявлены недостатки традиционного способа и установлены основополагающие отличительные признаки нового технического решения на способ выделения чистой культуры P. multocida первой генерации после in vivo. Для его применения сформулирован стандарт условий. Для обеспечения единства условий методологии выделения, оценки и применения чистой культуры (штамма) возбудителя пастереллёза Р. multocida разработан и предлагается для лабораторной практики способ (стандарт). Способ, включающий получение первой генерации микроорганизма на искусственной среде, отличается тем, что зараженную естественным путём или интраназально, или орально на слизистую оболочку носовой, ротовой, глоточной полостей и павшую от пастереллёза особь, выбранную из птицы или кролика, массой тела 350 г через 3 ч (при 20±1°С остывания трупа) вскрывают, берут пробу крови из сердца и вносят в стерильную воду при температуре 20±1°С в соотношении 1:9 по объёму, осадок встряхивают и переводят во взвесь, затем центрифугируют при 1500 об/мин 5 мин; надосадочную жидкость как изолят пастерелл из крови в разведении 10-1 разводят до 10-2, 10-3 и высевают при температуре 20±1°С на питательный бульон и питательный агар, посевы культивируют 9-19 ч при 37°С и 1 ч при 20°С. Полученную культуру оценивают чистой по строго типичной морфологии сплошного роста и однотипным колониям S-формы, по идентичным кокко- и диплококкоподобным капсулированным клеткам в полях зрения микроскопа, а также высокой вирулентности для восприимчивых лабораторных животных и птиц и с характерно выраженным свойством микробного антагонизма.

Ключевые слова: пастереллёз, Pasteurella multocida, диссоциация, условия восстановления, чистая культура, вирулентность, стандарт условий выделения, способ, аналитический обзор.

Сведения об авторе: Каширин Владимир Викторович, кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института - филиала Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0; e-mail: veterinar1987@mail.ru - ответственный за переписку с редакцией.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей