Изучение субхронической токсичности препарата «Прималакт» при интрацистернальном введении

УДК 619:615.281.9-065:618.19:636.028
DOI 10.33861/2071-8020-2020-5-11-13

Брюхова И.В., Востроилова Г.А., Хохлова Н.А., Чаплыгина Ю.А. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение
«Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии», г. Воронеж

Введение. Увеличение численности поголовья крупного рогатого скота и повышение его продуктивности является основной задачей животноводства страны. В связи с этим решающая роль в дальнейшей интенсификации молочного животноводства принадлежит изучению этиологии воспалений молочной железы у высокопродуктивных молочных коров. Одним из наиболее распространенных заболеваний маточного поголовья является мастит, патогенез которого обуславливает развитие различных метаболических и функциональных нарушений и целого каскада иммунологических реакций в организме [3, 17, 18, 19]. При этом производители молока предъявляют требования к показателям продуктивного стада, одним из которых является сведение процента заболеваемости молочных коров маститами к нулю [8, 9].

В настоящее время в молочном скотоводстве приоритетными средствами профилактики и терапии маститов являются антибактериальные моно- или комплексные препараты с действующими веществами из разных групп [2, 10]. Зачастую необоснованное и бесконтрольное применение антибактериальных средств в лечебных и профилактических целях в сельском хозяйстве привело к антибиотико-резистентности, которая сегодня является общемировой проблемой [1, 15, 16]. Разработка единой стратегии рационального применения антимикробных препаратов в животноводстве является основным путем решения проблемы предотвращения возникновения и распространения устойчивых штаммов бактерий [14].

Появление антибиотикоустойчивых микроорганизмов вызывает необходимость не только поиска и получения новых антибиотиков, но и повышения их бактерицидного и лечебного действия, снижения токсичности [12].

Успешное внедрение в клиническую практику новых лекарственных препаратов ветеринарного назначения предполагает наличие в соответствии с современными требованиями доказательной базы о высокой степени эффективности и безопасности их применения. Для этого должен выполняться определенный порядок научных исследований на различных уровнях, важнейшим из которых является доклиническая оценка безопасности лекарственного средства на основе международных и российских стандартов к проводимым испытаниям [4, 7, 11].

Доклинические исследования проводятся с целью исключения у целевых видов животных неблагоприятных последствий применения лекарственного препарата в процессе клинических испытаний. В ходе доклинических исследований получают предварительную информацию о токсичности, эффективности, фармакологических свойствах, фармакокинетике и метаболизме изучаемого лекарственного средства [4, 11].

Эксперименты по оценке токсического действия являются обязательной и неотъемлемой составляющей программы доклинических исследований, включающей в себя изучение различных видов токсичности (острой, субхронической, хронической, репродуктивной и др.). Оценка действия препарата при его многократном повторном введении позволяет выявить токсические эффекты, органы-мишени и обратимость вызываемых повреждений. Сведения, полученные в ходе исследования субхронической токсичности, создают основу для обоснованного прогноза риска проведения клинических исследований лекарств [13].

На базе ФГБНУ «ВНИВИПФиТ» был разработан комплексный препарат «Прималакт», в состав которого входят цефотаксим, неомицин и преднизолон, предназначенный для лечения мастита в лактационный период и эндометрита у коров. По результатам исследования острой токсичности на лабораторных животных препарат был отнесен к IV классу опасности - вещества малоопасные (ГОСТ 12.1.007-76) [5, 6].

Целью исследования явилось изучение субхронической токсичности препарата «Прималакт» при интрацистернальном введении лак-тирующим коровам.

Материалы и методы исследований. Опыт по определению субхронической токсичности препарата «Прималакт» проводили в ООО «Воронежпищепродукт» Новоусманского района Воронежской области на 12 клинически здоровых коровах на 3-4 месяце лактации. Первая группа (n=3) - контрольная. Второй опытной группе (n=3) препарат, подогретый до 38°С в количестве 5 мл (1 шприц-дозатор), вводили интрацистернально в левую переднюю долю вымени в течение 7 дней после предварительного выдаивания молока и обработки сосков 70% этиловым спиртом (правая передняя доля служила контролем). Третьей опытной группе (n=3) препарат вводился аналогичным образом в количестве 10 мл (5 мл в левую переднюю долю вымени и 5 мл в левую заднюю). Правая передняя и правая задняя доли вымени служили контролем. Четвертой опытной группе (n=3) препарат вводился аналогичным образом в количестве 20 мл (5 мл в каждую долю вымени). Схема опыта представлена в таблице 1.

Таблица 1. Схема применения «Прималакта» в рамках опыта по изучению субхронической токсичности препарата

Группа  животных	Доли вымени				Суммарная  доза
	Левая передняя	Левая задняя	Правая передняя	Правая задняя
1-я контроль	-	-	-	-	-
2-я опытная	5 мл	-	К*	-	5 мл
3-я опытная	5 мл	5 мл	К*	К*	10 мл
4-я опытная	5 мл	5 мл	5 мл	5 мл	20 мл

Примечание: *К - контрольная доля вымени

Перед введением препарата, в течение опыта ежедневно и через 48 часов после последнего введения препарата определяли состояние опытных и контрольных четвертей вымени визуально и при помощи пальпации.

Влияние длительного введения «Прималакта» на организм здоровых коров определяли по показателям общего состояния организма животных (температура тела, частота пульса, количество дыхательных движений, сокращений рубца) до введения, ежедневно в течение опыта и через 48 часов после последнего введения.

Для определения влияния препарата на морфологический и биохимический статус организма коров, были взяты пробы крови из яремной вены через сутки после последнего интрацистернального введения «Прималакта». Морфологические показатели крови определяли на гематологическом анализаторе «АВХ Micros 60» («ABX Diagnostics», Франция); лейкоцитарная формула - общепринятым методом, биохимические исследования сыворотки крови проведены на анализаторе «Hitachi-902», фракции белка - электрофорезом в агарозном геле, количество общего белка, липидов и билирубина - наборами фирмы «Витал» (Санкт-Петербург).

Статистическая обработка полученных данных проведена с помощью компьютерного пакета программ Statistica 6.0 и представлена в виде средней арифметической и ошибки средней арифметической (М+m). Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты исследований и их обсуждение. В первой, второй и третьей группах визуально опытные и контрольные доли вымени не отличались друг от друга. Местная температура опытных четвертей молочной железы не повышалась. Надвымянные лимфатические узлы по консистенции, подвижности и величине соответствовали исходным данным. Кожа оставалась эластичной и безболезненной. В четвертой опытной группе после пятого введения препарата пальпаторно было установлено повышение температуры долей вымени, их уплотнение, незначительная болезненность, появление хлопьев в секрете вымени и снижение молочной продуктивности. Реакция с диагностикумом регистрировалась в три-четыре креста. В связи с отмеченными явлениями продолжение опыта в четвертой опытной группе было прекращено.

Установлено, что в течение опыта температура тела, частота пульса, количество дыхательных движений и сокращений рубца находились в пределах нормативных значений для данного вида животных (табл. 2).

Таблица 2. Влияние длительного применения «Прималакта» на показатели общего состояния организма коров при интрацистернальном введении

Референсные значения	Показатели
	Температура, °С	Частота пульса в мин.	Частота дыхания в мин.	Руминация, кол./2 мин
	37,5-39,5	50-80	10-30	2,8-4
Первая группа (контроль)
До введения	38,6±0,3	59,7±2,1	21,5±1,7	3,4±0,1
2-е сутки	38,9±0,3	56,2±1,4	18,2±1,6	3,3±0,2
4-е сутки	38,6±0,2	60,0±2,0	20,0±1,3	3,7±0,3
8-е сутки	38,4±0,3	57,3±1,5	20,3±1,4	3,5±0,3
48 ч после последнего введения	38,1±0,2	57,2±2,5	20,6±1,8	3,3±0,2
Вторая (опытная) группа
До введения	38,2±0,3	60,5±1,5	22,5±1,4	3,0±0,2
2-е сутки	37,9±0,2	63,3±2,0	23,3±1,6	3,7±0,3
4-е сутки	38,5±0,2	64,7±1,6	24,5±1,5	3,4±0,3
8-е сутки	38,3±0,4	65,6±2,2	25,2±1,3	3,5±0,3
48 ч после последнего введения	38,3±0,2	63,1±2,4	24,7±1,6	3,4±0,2
Третья (опытная) группа
До введения	38,0±0,3	63,8±2,1	20,9±1,7	2,9±0,2
2-е сутки	38,3±0,2	64,2±1,9	20,8±1,3	3,4±0,3
4-е сутки	38,6±0,3	65,5±1,5	22,1±1,9	3,3±0,2
8-е сутки	37,9±0,3	65,3 ±1,3	23,1±2,0	3,5±0,2
48 ч после последнего введения	38,0±0,5	64,9±2,0	23,0±1,8	3,5±0,2
Четвертая (опытная) группа
До введения	38,5±0,3	55,5±2,2	31,3±1,7	2,9±0,2
2-е сутки	39,0±0,2	52,3±1,9	32,2±1,6	2,7±0,3
4-е сутки	39,9±0,3	51,6±2,3	30,8±2,0	2,5 ±0,2

Уровень обменных процессов, протекающих в организме, и физиологическое состояние лактирующих коров влияют на морфологический состав крови, её физико-химические свойства, а также на продуктивность животного. Картина крови наиболее полно отражает разнообразные биохимические и физические процессы, происходящие в организме, и изменяется при возникновении патологических процессов [5]. Результаты исследований морфологического и биохимического статуса коров представлены в таблице 3.

Таблица 3. Морфологические и биохимические показатели крови коров после введения препарата «Прималакт»

Показатели	Контроль	2-я опытная группа	3-я опытная группа
Эритроциты, 1012/л	6,4±0,6	6,3+0,8	6,1+0,2
Лейкоциты, 109 /л	11,0+0,5	10,6+0,8	10,9+0,8
Гемоглобин, г/л	108,1+4,6	108,6+3,1	111,6+6,8
Гематокрит, %	31,2+1,0	30,8+2,0	31,4+0,8
Нейтрофилы, % палочкоядерные	4,2±0,6	3,9+0,6	3,7+0,1
сегментоядерные	31,8+1,0	32,0+1,2	30,9+0,6
Эозинофилы, %	5,0±2,2	5,2+1,3	4,9+0,8
Базофилы, %	0,9±0,6	-	1,0+0,2
Моноциты, %	2,3±0,1	2,2+0,8	2,5+0,7
Лимфоциты, %	55,8+2,7	56,7+1,2	57,0+3,9
Общий белок, г/л	96,2+2,0	91,2+3,3	89,2+6,9
Альбумины, %	48,8+0,7	48,2+1,3	46,2+2,1
a - глобулины, %	7,2±0,6	7,0+0,9	8,3+0,3
в-глобулины, %	11,3+1,2	12,0+0,8	12,6+0,5
Y-глобулины, %	32,7+1,3	32,8+1,6	32,9+0,3
Мочевина, мМ/л	6,5+1,0	6,2+0,6	5,9+0,4
Общие липиды, г/л	3,8+0,3	3,6+0,2	3,2+0,2
ЩФ, Е/л	75,1+4,0	75,4+6,2	81,4+5,9
АсАТ, Е/л	69,8+6,6	67,0+6,2	64,6+4,8
АлАТ, Е/л	32,0+2,1	32,1+2,0	29,5+1,3
Общий кальций, мМ/л	2,2+0,2	2,2+0,1	2,67+0,2
Фосфор неорган., мМ/л	1,6+0,4	1,6+0,2	1,71+0,12

Как следует из данных таблицы 3, интрацистернальное введение препарата «Прималакт» в течение 9 дней в дозе 5 мл и 10 мл лакти-рующим коровам не вызвало сдвигов в морфологических и биохимических показателях крови.

Пробы крови от коров 4-ой группы (доза 20 мл) не отбирали, так как данная группа выбыла из эксперимента на 5-е сутки по причине возникновения реакции молочной железы на пятикратное введение «Прималакта».

Заключение. В опыте по изучению субхронической токсичности препарата «Прималакт» установлено, что при интрацистернальном введении лактирующим коровам в дозах 5 и 10 мл на животное в течение 9-ти суток реакция молочной железы отсутствовала; общее состояния организма животных (температура тела, частота пульса, количество дыхательных движений, сокращений рубца) было без изменений; морфологические и биохимические показатели крови коров достоверно не изменялись. Однако, в группе с дозировкой препарата 20 мл на животное на 5-е сутки применения «Прималакта» отмечали негативную реакцию со стороны молочной железы. Результаты полученных исследований в четвертой опытной группе нашли свое отражение в инструкции по применению препарата, где указано, что кратность введения препарата составляет 3-4 дня.

Список литературы:

1. Андрюков Б.Г., Недашковская Е.П. Вступая в пост-антибиотиковую эру: перспективные стратегии поиска новых альтернативных стратегий борьбы с инфекционными заболеваниями/ Б.Г. Андрюков, Е.П. Недашковская// Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2018. № 3 (75). С. 36-50. DOI: 10.5281/zenodo.1488026.
2. Артемьева О.А Антибиотикорезистентность штаммов Staphylococcus aureus, выделенных из молока высокопродуктивных коров// Сельскохозяйственная биология. 2016. № 6. С. 867-874. DOI: 10.15389/agrobiology.2016.6.867rus.
3. Ашенбреннер А.И. Исследование острой токсичности комплексного тканевого препарата/ А.И. Ашенбреннер, Н.Ю. Беляева, Ю.А. Чекункова, Ю.А. Хаперский// Вестник АГАУ. 2018. № 7 (165). С. 122-127.
4. Бирюкова Н.П. Общие принципы доклинической оценки безопасности фармакологических лекарственных средств для ветеринарного применения// Н.П. Бирюкова, С.В. Русаков, В.В. Напалкова// Ветеринарный врач. 2018. № 1. С. 3-9.
5. Брюхова И.В. Острая токсичность прималакта и влияние его на биохимический статус коров/ И.В. Брюхова, Н.И. Шумский, Ю.Н. Масьянов// Международный вестник ветеринарии. 2015. № 3. С. 62-66.
6. Брюхова И.В. Эффективность применения прималакта для лечения эндометритов у коров// Ученые записки учреждения образования Витебская ордена Знак почета государственная академия ветеринарной медицины. 2017. Т. 53. № 2. С. 22-25.
7. Енгалычева Г.Н. Стандарты качества доклинических фармакологических исследований/ Г.Н. Енгалычева, Р.Д. Сюбаев, Д.В. Горячев// Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2019. 9(4). С. 248-255. DOI: 10.30895/1991-2919-2019-9-4-248-255.
8. Жданова И.Н. Влияние фитобактериального комплекса БЦЛ на морфобиохимический статус коров при клинической форме мастита/ И.Н. Жданова// Вестник Пермского федерального исследовательского центра. 2018. № 3. С. 51-57. DOI: 10.7242/1998-2097/2018.3.5
9. Новиков В.В. Оценка терапевтической эффективности противомаститных препаратов в условиях молочно-товарных ферм краснодарского края/ В.В. Новиков, Н.Ю. Басова, Р.А. Махфуз, А.В. Скориков// Сборник научных трудов СКНИИЖ. 2019. № 3. С. 180-183. DOI: 10.34617/2m3k-aa15.
10. Пименов Н.В. Изучение профилактической и лечебной эффективности препарата бактериофагов при маститах у коров в условиях молочно-товарной фермы// Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences, 2016. № 5 (53). С 8389. DOI: 10.18551/rjoas.2016-05.11.
11. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая/ Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.
12. Самуйленко А.Я. Биотехнологическое обоснование редуцирования токсичности и потенцирование эффективности лечебно-профилактических препаратов/ А.Я. Самуйленко, И.Н. Матвеева, Д.А. Евглевский, А.А. Евглевский, Г.Е. Гребенникова// Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. 2015. № 6. С. 64-65.
13. Сорокина А.В. Опыт проведения клинико-лабораторных исследований в доклинической оценке безопасности лекарств (часть 1: гематологические исследования)/ А.В. Сорокина, С.В. Алексеева, Н.В Еремина. А.Д Дурнев// Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. 2019. № 9 (3). С. 197-206. DOI: 10.30895/1991-2919-2019-9-3-197-206.
14. Татарникова Н.А. Использование экдистероидсодержащих препаратов в схеме лечения мастита у коров/ Н.А. Татарникова, И.Н. Жданова// Известия ОГАУ. 2019. № 6 (80). С. 208-211.
15. Abedon S.T., Kuhl S.J., Blasdel B.G. et al. Phage treatment of human infections. Bacteriophage 2011. 1 (2): 66-85. DOI: 10.1016/j.tibtech.2010.08.001.
16. Baltzer S.A., Brown M.H. Antimicrobial peptides - promising alternatives to conventional antibiotics. J. Mol Microbiol Biotechnol 2011. 20 (4): 228-235. DOI: 10.1159/000331009.
17. Van Dorland H.A., Richter S., Morel I., et al. (2009). Variation in hepatic regulation of metabolism during the dry period and in early lactation in dairy cows. J. Dairy Sci. Vol. 92 (5). P. 1924-1940.
18. Walt D.R. (2013). Optical methods for single molecule detection and analysis. Analytical Chem. Vol. 85 (3). P. 1258-1263.
19. Wellnitz O., Arnold E.T., Bruckmaier R.M. (2011). Lipopolysaccharide and lipoteichoic acid in- duce different immune responses in the bovine mammary gland. J. Dairy Sci. Vol. 94 (11). P. 5405-5412.

Резюме. В настоящее время проблема лечения и профилактики заболеваний молочной железы у коров является актуальной. В связи с этим задача разработки новых лекарственных средств для борьбы с маститами, обладающих широким спектром антимикробного действия и минимальными побочными эффектами, остается востребованной. Авторами была изучена субхроническая токсичность препарата «Прималакт» при интрацистернальном введении лактирующим коровам. Опыт проводили на 12 клинически здоровых коровах на 3-4 месяце лактации. Было сформировано 3 опытные и 1 контрольная группы. Животным в опытных группах в течение 9 дней интрацистернально вводили препарат в дозах 5, 10 и 20 мл, соответственно. Данные осмотра показали отсутствие значимых изменений клинического состояния подопытных животных и тканей молочной железы в двух опытных группах. В группе с дозой 20 мл на 5-е сутки было установлено повышение температуры долей вымени, их уплотнение, незначительная болезненность, появление хлопьев в секрете вымени и снижение молочной продуктивности, что свидетельствует в данном случае о наличии раздражающего действия. Введение препарата «Прималакт» в течение 9 дней в дозе 5 мл и 10 мл лактирующим коровам не вызвало сдвигов в морфологических и биохимических показателях крови. Результаты полученных исследований в четвертой опытной группе нашли свое отражение в инструкции по применению препарата, где указано, что кратность введения препарата составляет 3-4 дня. Таким образом, препарат «Прималакт» при интрацистернальном введении лактирующим коровам в течение 9 суток в дозах 5 и 10 мл не обладает субхронической токсичностью.

Ключевые слова: крупный рогатый скот, лактирующие коровы, молочная железа, мастит, «Прималакт», комплексный препарат, интрацистернальное введение препарата, субхроническая токсичность, морфология и биохимия крови, показатели крови.

Сведения об авторах:

Брюхова Ирина Викторовна, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник отдела экспериментальной фармакологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии»; 394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114-б; тел.: 8-903-6526316; e-mail: irina.bryuhova@mail.ru.

Востроилова Галина Анатольевна, доктор биологичеких наук, главный научный сотрудник отдела экспериментальной фармакологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии»; 394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114-б; тел.: 8-906-6781203; e-mail: gvostroilova@mail.ru.

Чаплыгина Юлия Алексеевна, младший научный сотрудник отдела экспериментальной фармакологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии»; 394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114-б; тел.: 8-951-5553510; e-mail: kantorovich.yuliya@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Хохлова Нина Алексеевна, научный сотрудник отдела экспериментальной фармакологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научноисследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии»; 394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114-б; тел.: 8-908-1376923; e-mail: nina_xoxlova@mail.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей