Частота выявления генома вируса инфекционного ринотрахеита у крупного рогатого скота при патологии воспроизводства в хозяйствах молочного направления

УДК 619:616.98:578.825.15:618.1/636.2

Котенева С.В., Семенова О.В., Глотова Т.И., Глотов А.Г. ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук, Новосибирская область, пос. Краснообск
Кощаев А.Г., Родин И.А. ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени
И.Т. Трубилина», г. Краснодар

Введение. Репродуктивное здоровье стада - основа экономической эффективности индустрии молочного и мясного г животноводства. Факторы, влияющие на воспроизводительные функции коров и телок, могут быть разными и варьируют от хозяйственных причин до сложного комплекса различных болезней [1, 5].

В настоящее время в Российской Федерации интенсивно развивается молочное скотоводство, что сопровождается сосредоточением большого числа высокопродуктивных животных, в том числе завезенных из других стран, на ограниченных территориях. В данной ситуации возрастает значение вирусных инфекций [2, 9]. Одной из болезней, снижающих эффективность этой отрасли, является инфекционный ринотрахеит (далее, ИРТ) - широко распространенная инфекция крупного рогатого скота, возбудителем которой является Bovine herpesvirus - 1 (BHV-1). Согласно современной классификации вирус относится к порядку Herpesvirales, семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirinae, роду Varicellovirus [11].

Существует один генетический тип вируса и три субтипа (1.1 -респираторные, 1.2 а/в - генитальные и 1.3 - выделенные от животных с признаками менингоэнцефалитов), различающиеся по вирулентности [14].

Респираторная форма болезни у телят в нашей стране изучена достаточно полно [3, 6, 7], однако, данных о влиянии вируса на воспроизводительные функции крупного рогатого скота недостаточно. Мало данных о частоте выявления и полиморфизме генома вируса при патологии воспроизводства крупного рогатого скота, особенно на крупных молочных комплексах.

Последствием респираторной инфекции неиммунных стельных особей является инфицирование плода и аборты, происходящие во второй стадии стельности, чаще между 4-м и 8-м месяцами. Занос вируса в неиммунное стадо животных может привести к массовым абортам, при этом могут абортировать от 25 до 60% маточного поголовья [15]. В стационарно неблагополучных хозяйствах инцидентность абортов ниже.

Наряду с респираторной распространена и генитальная форма болезни, проявляющаяся в виде пустулезного вульвовагинита у телок и коров и баланопостита у быков. Она характеризуется формированием множественных мелких узелков, везикул, фокальных некрозов и язв на воспаленных слизистых оболочках, проявляющихся «транзит-но» и самостоятельно исчезающих в течение 1-2-х недель. Аборты при данной форме болезни не происходят [12, 13].

Признаки «классического» ИРТ-ИПВ у коров, описанные в литературе, встречаются относительно редко. Как правило, течение основного заболевания сопровождается развитием секундарной инфекции [3]. Основной источник возбудителя - животные с острой формой (а также субклинически больные) и, особенно, латентно инфицированные. Поэтому опасны ситуации, когда вместе собирается скот с неизвестным статусом к вирусу ИРТ или из разных мест (на выставках, откормочных площадках, транспортировка) [3, 9, 10]. В эпизоотологии болезни большую роль играют латентно инфицированные быки-производители, распространяющие вирус через инфицированную сперму [2].

В связи с увеличением объемов завозимых в нашу страну племенных животных и животноводческой продукции возрастает опасность заноса возбудителя ИРТ крупного рогатого скота, что может привести к серьезным экономическим потерям вследствие болезни, падежа молодняка, репродуктивных проблем, проведения дополнительных ветеринарных мероприятий, ограничения международной торговли скотом.

В данной ситуации приобретает большое значение проведение мониторинга инфекционных агентов в хозяйствах с целью выбора оптимальной стратегии профилактических мероприятий и типа вакцин.

Ранее нами был разработан способ дифференциации штаммов и изолятов вируса на основе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ-анализ) [4].

В связи с этим целью данной работы являлось изучение частоты выявления генома вируса ИРТ крупного рогатого скота у животных с наличием патологии воспроизводства в хозяйствах молочного направления при помощи полимеразной цепной реакции с последующим определением рестрикционного профиля.

Материалы и методы исследований. Исследования проводили с 2001 по 2014 годы в хозяйствах Сибири, где не осуществлялась специфическая профилактика инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. В некоторые из них ввозились животные из других стран и регионов России.

При изучении распространения ИРТ крупного рогатого скота использовали результаты собственных серологических и вирусологических исследований. Высчитывали средний процент проб сыворотки крови, содержащих вируснейтрализующие антитела к вирусам, от числа поступивших из хозяйств с различной концентрацией животных, где наблюдались вспышки гинекологических заболевание животных.

Пробы биоматериала - вагинальные выделения, экссудат из матки, кусочки плаценты - отбирали от ремонтных телок случного возраста, нетелей, первотелок, коров дойных и в запуске с наличием или отсутствием видимой гинекологической патологии. От абортплодов и мертворожденных телят брали пробы головного мозга и внутренних органов.

Пробы биоматериала отбирали в объеме 1 см3, готовили 10%-ные суспензии на физиологическом растворе. ДНК выделяли с использованием комплекта реагентов «ДНК-сорб» производства ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

Для скрининговых серологических исследований пробы сыворотки крови отбирали от животных однократно, а для проведения ретроспективной диагностики ИРТ крупного рогатого скота - двукратно с интервалом 21-30 дней. Всего исследовали 1 173 пробы сыворотки крови.

Наличие антител в сыворотке крови животных определяли в реакции микронейтрализации в перевиваемой культуре клеток MDBK согласно стандарту МЭБ (OIE Manual, Manual of Standards//Chapter 2.3.5, 2015).

Цифровые значения титров вируснейтрализующих антител указывали в логарифмах по основанию 2. При анализе полученных результатов определяли средние величины и среднеквадратическое отклонение (М ± СКО).

Молекулярные исследования проводили методом полимеразной цепной реакции с помощью тестсистемы, разработанной нами, согласно наставлению по применению, с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ). Для гидролиза использовали эндонуклеазы рестрикции HpaI и SacII. Всего исследовали 588 проб биоматериала от коров и нетелей, ткани от 67 абортплодов и 56 мертворожденных телят.

Результаты и их обсуждение. При клиническом обследовании животных выявляли острые и хронические метриты и эндометриты, вульвовагиниты, аборты, рождение нежизнеспособного приплода, задержание последа, нарушение полового цикла, снижение массы тела и удоев, болезни телят.

Сервис-период по отдельным хозяйствам составлял более 130 дней, при норме 60-75 дней, а количество животных, плодотворно осемененных после первого раза, колебалось от 50 до 56,5%, второго - от 20 до 25%. В некоторых хозяйствах требовалось до 6-7-и осеменений телок.

Результаты серологических исследований, проведенных в хозяйствах Сибири, показали широкое распространение ИРТ среди крупного рогатого скота. Серопозитивность коров и нетелей к вирусу ИРТ составила в среднем по хозяйствам 72,0%.

Анализ ведения животноводства в обследованных хозяйствах выявил следующие закономерности. В мелких хозяйствах с численностью дойных коров до 500 голов и молочной продуктивностью до 4 500 л в год количество положительно реагирующих животных в стаде составило в среднем 64,2%. На молочных комплексах (от 800 голов, продуктивность 5 500 - 7 000 л в год) без завоза импортного скота уровень серопозитивности составил 68%. Вероятно, это связано с широким охватом коров искусственным осеменением, высокой молочной продуктивностью (особенно резким ее повышением), наличием стрессовых факторов, приводящих к активизации вирусов и их пассированию на естественно восприимчивых животных, что способствует повышению их вирулентных свойств. Наиболее высокий уровень серопозитивности (86,1%) отмечен у животных на крупных молочных комплексах, на которых производился завоз импортного скота. Интенсивность проявления ИРТ крупного рогатого скота зависит от концентрации животных в хозяйствах и их продуктивности, в частности, молочной. Анализ величин титров вируснейтрализующих антител к вирусу показал, что их значения повышаются в зависимости от концентрации поголовья в хозяйстве. Это свидетельствует о более широкой циркуляции вируса в таких хозяйствах и его участии в патологии репродуктивных органов у животных.

При исследовании парных проб сыворотки крови от больных животных сероконверсию, сопровождающуюся четырехкратным и более приростом титров нейтрализующих антител, выявили у 59,6% коров и нетелей при острых вспышках ИРТ КРС. Сероконверсию выявляли как у животных, поступивших по импорту, так и отечественной селекции

Результаты исследований по выявлению генома вируса ИРТ КРС в пробах биоматериала представлены в таблице 1.

Таблица 1. Частота выявления генома вируса инфекционного ринотрахеита у крупного рогатого скота при патологии воспроизводства

Категория животных/ биоматериал	Вид биоматериала	Исследовано проб	Выявлено положительных проб / % от числа исследованных
Аборт-плоды	Внутренние органы	67	18/26,9
Мертворожденные телята		56	19/34
Первотелки и коровы после отела или аборта	Вагинальные и маточные выделения	577	129/22,4
	Плацента	11	4/36,4
Итого:		711	170/23,9

Результаты показали, что геном вируса выявили в среднем у 26,9% абортплодов 6-8-и месячного возраста и 34% мертворожденных телят. Он присутствовал в паренхиматозных органах, а в некоторых случаях, в головном мозге. В большинстве случаев у матерей выявляли сероконверсию к вирусу после аборта. У абортированных плодов обнаруживались сильные аутолитические изменения внутренних органов, что обусловлено гибелью плодов в матке до аборта. Вирус присутствовал в 22,4% вагинальных и маточных выделений и 36,4% пробах плаценты первотелок и коров.

Учитывая циркуляцию возбудителя среди восприимчивого поголовья, большой интерес вызывает определение субтипа вируса, циркулирующего в конкретном стаде животных. Для дифференциации генома вируса нами был проведен ПЦР-ПДРФ анализ с использованием эндонуклеаз рестрикции HpaI и SacII [4].

При проведении ПДРФ-анализа с помощью эндонуклеазы рестрикции SacII у вакцинного штамма ТК-А отсутствовал сайт узнавания, но эпизоотические штаммы рестриктировались этим ферментом. При проведении электрофореза трек с вакцинным штаммом после рестрикции содержал одну полосу ДНК размером 464 н.п., а эпизоотические - 2 или 3 полосы, нижние из которых соответствовали размеру 343 и 121 н.п. (рисунок 1).

Рис. 1. ПДРФ-анализ изолятов BHV-1 при помощи эндонуклеазы SacII: 1 - маркер молекулярного веса (MspI, гидролизат плазмиды pUC19); 2 - штамм «ТК-А»; 3 - штамм «ТК»; 4 - изолят из маточных выделений коровы; 5 - изолят из вагинальных выделений коровы; 6 - изолят из вагинальных выделений коровы; 7 - изолят из органов абортплода; 8 - штамм «Оренбург».

При гидролизе эндонуклеазой HpaI штаммы ТК и ТК-А не имели сайтов рестрикции, а для штамма Оренбург были получены 2 полосы, которые соответствовали размеру 254 и 210 н.п. (рисунок 2).

Рис. 2. ПДРФ-анализ изолятов BHV-1 при помощи эндонуклеазы HpaI: 1 - маркер молекулярного веса (MspI, гидролизат плазмиды pUC19); 2 - штамм «ТК-А»; 3 - штамм «ТК»; 4 - изолят из маточных выделений коровы; 5 - изолят из вагинальных выделений коровы; 6 - изолят из вагинальных выделений коровы; 7 - изолят из органов абортплода; 8 - штамм «Оренбург».

Результаты типирования показали, что большая часть изолятов вируса, выявленных у животных с наличием репродуктивной патологии, относилась к респираторному субтипу вируса 1.1., что подтверждает существующее мнение о том, что аборты вызывают респираторные штаммы вируса (Cooper-подобные).

По результатам ПЦР-ПДРФ анализа 60% исследованных изоля-тов вируса были отнесены нами к субтипу 1.1. (Cooper-подобные), что соответствует рестрикционному профилю «респираторных» штаммов, 33% - к субтипу 1.2. (ТК- подобные), выделяющие чаще при генитальной форме болезни. 4% изолятов отнесены к группе «ТК-А-подобных», имеющих вакцинную природу. 3% изолятов имели «смешанный» рестрикционный профиль (Cooper- и ТК-А-подобные), что говорит о совместной циркуляции вакцинного штамма и полевых изолятов вируса ИРТ крупного рогатого скота.

В наших исследованиях мы не выявили разницы в частоте выявления вируса от инфицированных животных импортной или отечественной селекции. По нашему мнению, на частоту выявления вируса оказывают влияние концентрация животных, перегруппировки и высокая молочная продуктивность, способствующая нарушению обмена веществ и возникновению иммунодефицитных состояний.

Полученные результаты показали также, что на молочных комплексах преобладают «респираторные» штаммы вируса, вызывающие аборты у взрослых животных и респираторный синдром у молодняка. Генитальные штаммы выявляются значительно реже.

В связи с этим для установления роли возбудителя в патологии воспроизводства на молочных комплексах необходимо проводить диагностические (серологические и молекулярные) исследования. Наличие циркуляции вируса среди восприимчивого поголовья необходимо учитывать при планировании профилактических мероприятий.

Выводы:

1. Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота широко распространен во всех обследованных молочных хозяйствах Сибири. Серопозитивность крупного рогатого скота различных половозрастных групп в среднем составила 72,0%. Из них, в мелких хозяйствах ее

показатели были равны 64,2%, в средних - 68%, в крупных - 86,1%. Болезнь чаще протекала субклинически, признаки «классического» вульвовагинита у коров регистрировали редко.

2. Геном вируса выявляли в пробах биологического материала от животных из хозяйств, неблагополучных по гинекологической патологии, в среднем в 23,9% от числа исследованных. Геном вируса присутствовал во внутренних органах 26,9% абортплодов 6-8-и месячного возраста и 34% мертворожденных телят. В большинстве случаев у матерей выявляли сероконверсию к вирусу после аборта. Вирус выявили в 22,4% проб вагинальных и маточных выделений и 36,4% проб плаценты первотелок и коров. Полученные данные свидетельствуют об участии вируса в патологии воспроизводства крупного рогатого скота в молочных хозяйствах.

3. По данным рестрикционного анализа, среди животных обследованных хозяйств преимущественно циркулируют штаммы «респираторного» субтипа, выявление которых было равно 60%, что подтверждает их роль в возникновении абортов. Штаммы «генитального» профиля встречаются реже (33%). Рестрикционный профиль аттенуированного вакцинного штамма «ТК-А» имели только 4% изолятов, а 3% имели «смешанный» рестрикционный профиль, что свидетельствует о совместной циркуляции вакцинного штамма и полевых изолятов у животных.

Список литературы:

1. Белобороденко М.А., Белобороденко Т.А., Белобороденко А.М., Бело-бороденко Д.Ф., Дёмкина А.В., Губский В.И., Родин И.А., Дубровин И.И., Писарева Ю.А. Профилактика репродуктивных расстройств у коров//Ветеринария Кубани. 2016, № 2. С. 10-12.
2. Глотов А.Г. Распространение вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота/ А.Г. Глотов, О.Г. Петрова, Т.И. Глотова, А.В. Нефедченко, А.Т. Татарчук, С.В. Котенева, Г.В. Ветров, А.Н. Сергеев // Ветеринария. 2002, № 3. С. 17-21.
3. Глотов А.Г., Шуляк А Ф , Глотова Т.И., Сергеев А .Н. Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота Монография. РАСХН. Сиб. отд-ние, ГНУ ИЭВ-СиДВ.- Новосибирск, 2006.- 196 с.
4. Жираковская Е.В., Орешкова С.Ф., Глотов А.Г., Тикунова Н.В., Глотова Т.И., Носкова Н.В., Ильичев А.А., Котенева С.В., Некрасова Н.В. Дифференциация изолятов вируса ИРТ КРС с помощью ПЦР-ПДРФ анализа. Ветеринария. 2004, № 11. С. 17-20.
5. Кощаев А.Г. Усенко ВВ., Лихоман А.В. Здоровье животных - основной фактор эффективного животноводства//Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. 2014, № 99. С. 201-210
6. Крюков Н.Н. Инфекционный ринотрахеит - пустулёзный вульвоваги-нит крупного рогатого скота / Н.Н. Крюков // Итоги науки и техники / Животноводство и ветеринария.- М. - 1980. - С. 32- 113.
7. Мищенко В.А., Гетманский О.И., Ручнов Ю.Е., Костыркин Ю.А. Особенности эпизоотологии инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота // Материалы научно-практической конф. - Новосибирск. 2001. С.12 - 14.
8. Юров К.П. Распространение инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота в различных регионах России / К.П. Юров, А.Ф. Шуляк, О.Г. Петрова и др. // Труды ВИЭВ.-73.- 2003.- С. 15-22.
9. Ata A., Kale M., Bulut O., Buyukyoruk U.: The effect of subclinical bovine herpesvirus 1 infection on fertility of cows and heifers// Acta Vet (Beograd), 2006, 56:267-273.
10. Biswas S., Bandyopadhyay S., Dimri U.H., Patra P. Bovine herpesvirus-1 (BHV-1) - a reemerging concern in livestock: a revisit to its biology, epidemiology, diagnosis, and prophylaxis // Vet Quarterly, 2013, V. 33. P. 68 - 81.
11. Davison A. J. Herpesvirus systematics// Vet. Microbiol., 143, 2010, 52-69.
12. Graham D. A. Bovine herpes virus-1 (BoHV-1) in cattle-a review with emphasis on reproductive impacts and the emergence of infection in Ireland and the United Kingdom// Graham Irish Veterinary Journal, 2013, 66:15.
13. Kelling C.L. Viral diseases of the fetus. In: Youngquist R.S., Threlfall W.R., editors. Current therapy in large animal theriogenology. 2nd ed., St. Louis, Elsevier. 2007, 399-408.
14. Metzler A.E., Matile H., Gassmann U. et al. European isolates of bovine herpesvirus 1: a comparison of restriction endonuclease sites, polypeptides and reactivity with monoclonal antibodies// Arch. Virol., 1985, Vol.85 (№1-2), 57-69.
15. Smith K.C. Herpesviral abortion in domestic animals// Vet J., 1997, 153:253-268.

Резюме. Представлены данные по изучению серологического статуса животных к вирусу инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и частоты выявления генома вируса методом ПЦР-ПДРФ-анализа. Установлено широкое распространение ИРТ крупного рогатого скота в молочных хозяйствах Сибири. Серопозитивность коров и нетелей к вирусу ИРТ крупного рогатого скота составила в среднем по хозяйствам 72,0%. В мелких хозяйствах серопозитивность составила 64,2%, в средних - 68%, в крупных - 86,1%. Геном вируса выявляли в пробах биологического материала от животных из хозяйств, неблагополучных по гинекологической патологии, в среднем в 23,9% от числа исследованных. Геном вируса присутствовал в органах 26,9% абортированных плодов 6-8 месячного возраста, 34% мертворожденных телят, 22,4% проб вагинальных и маточных выделений, 36,4% проб плаценты первотелок и коров. В большинстве случаев у матерей выявляли сероконверсию к вирусу после аборта. По результатам ПЦР-ПДРФ-анализа 60% изолятов вируса отнесены к к субтипу 1.1. (Cooper-подобные), что соответствует рестрикционному профилю «респираторных» штаммов; 33% - к субтипу 1.2. (ТК-подобные), выделяющие чаще при генитальной форме болезни; 4% - к группе «ТК-А-подобных», имеющих вакцинную природу; 3% изолятов имели «смешанный» рестрикционный профиль (Cooper- и ТК-А-подобные), что свидетельствует о совместной циркуляции вакцинного штамма и полевых изолятов вируса ИРТ крупного рогатого скота. Наличие циркуляции вируса среди восприимчивого поголовья необходимо учитывать при планировании профилактических мероприя-тий.

Ключевые слова: инфекционный ринотрахеит, вирус, крупный рогатый скот, коровы, патология репродуктивной системы, серологические исследования, полимеразная цепная реакция, ПЦР-ПДРФ-анализ.

Сведения об авторах:

Котенева Светлана Владимировна, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии диагностического центра ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук (СФНЦА РАН); 630501, Новосибирская область, пос. Крас-нообск, а/я 463; тел.: 8-383-3087745; e-mail: koteneva-sv@mail.ru.

Семенова Ольга Владимировна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории вирусологии ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук (СФНЦА РАН); 630501, Новосибирская область, пос. Краснообск, а/я 463; тел.: 8-383-3087745; e-mail: k-olga-83@mail.ru.

Глотова Татьяна Ивановна, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией вирусологии ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук (СФНЦА РАН); 630501, Новосибирская область, пос. Краснообск, а/я 463; тел.: 8-383-308-77-45; e-mail: t-glotova@mail.ru.

Кощаев Андрей Георгиевич, доктор биологических наук, профессор, проректор по научной работе ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина»; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13; тел.: 8-861-2215637; e-mail: koshhaev.a@kubsau.ru.

Родин Игорь Алексеевич, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры анатомии, ветеринарного акушерства и хирургии ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина»; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13; тел.: 8-861-2215942; e-mail: d22003807@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Глотов Александр Гаврилович, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий лабораторией биотехнологии диагностического центра ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук (СФНЦА РАН); 630501, Новосибирская область, пос. Краснообск, а/я 463; тел.: 8-383-3087745; e-mail: glotov_vet@mail.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей