Биохимические показатели сыворотки крови собак с моделью дегенеративно-дистрофических изменений коленного сустава на разных стадиях заболевания

УДК 363.7-092.9:616.72-007.17-008.8:612.398.12:612.015.31

Спиркина Е.С., Матвеева Е.Л., Гасанова А.Г., Степанов М.А. ФГБУ "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. Г.А. Илизарова" Минздрава России, г. Курган

Введение. Дегенеративные заболевания суставов приобретают всё большую медицинскую и социальную значимость, так как демографическая ситуация развитых стран характеризуется постарением населения, а образ жизни цивилизованного человека приводит к деградации суставного хряща даже в сравнительно молодом возрасте. Биохимический мониторинг внутренней среды организма и ранняя диагностика патологического процесса в суставах становятся все более актуальными.

В литературе известны способы моделирования остеоартроза в эксперименте путем воздействия на сустав химических, физических. механических и травматических факторов, но существует необходимость усовершенствования и разработки новейших методик моделирования дегенеративно-дистрофических изменений в суставах в эксперименте, для возможности исключения неблагоприятных факторов, вызывающих это заболевание [1, 3, 4, 9, 10].

Известно, что процессы пероксидации связаны с одним из главных факторов в патогенезе остеоартроза - нарушением трофики суставного хряща [6]. Нарушение микроциркуляции в суставных концах и функций сустава связывают с застойными явлениями и последующими развитиями дегенеративно-дистрофических процессов [1].

Целью данного исследования послужило изучение изменений в системе перекисного окисления липидов (ПОЛ) и окислительной модификации белков (ОМБ) у экспериментальных животных на ранних и поздних стадиях развития дегенеративно-дистрофических изменений в суставах (ДДИС).

Материалы и методы исследования. Экспериментальное моделирование остеоартроза проводили на взрослых беспородных собаках путем иммобилизации обоих коленных суставов с пересечением бедренной артерии по разработанному одним из авторов способу [8]. Основным материалом исследования являлась сыворотка крови 30 беспородных собак: интактных (n=10), с моделью ДДИС (n=20) на ранних стадиях (28 суток n = 14) и с моделью дегенеративных изменений в суставах на поздних стадиях заболевания (56 суток n=6). Критерием сроков эксперимента служила клинико-рентгенологическая характеристика состояния суставов.

Общее количество белка определяли биуретовым методом (наборы фирмы "Vital Diagnostic", г. Санкт-Петербург), электрофоретическое разделение белковых фракций проводили с использованием прибора для электрофореза Helena ("BioSciens Europe", Англия) производя расчет альбумин-глобулинового коэффициента, доли а-, р- и у-глобулинов. Продукты ОМБ в сыворотке крови определяли в белковом осадке по реакции 2,4-динитрофенилгидразином. Альдегиды ОМБ регистрировали при длинах волн 270 нм, 363 нм и 370 нм - (ОМБ270), - кетоны ОМБ (ОМБ363+370). Концентрацию продуктов ОМБ рассчитывали в единицах оптической плотности на мг белка [2].

В качестве количественных маркеров глубины и степени патологического процесса использовали такие промежуточные вещества ПОЛ, как диеновые конъюгаты (ДК) и малоновый диальдегид (МДА). Спектрофотометрически определяли по разности оптической плотности между опытной и контрольной пробами при длине волны 232 нм содержание ДК [7]. По реакции с тиобарбитуровой кислотой проводили определение МДА. Замер светопоглощения проводили при длине волны 532 нм, в кювете с длиной оптического пути 1 см [7]. Концентрации данных продуктов ПОЛ рассчитаны на мг общих липидов, которые определены наборами фирмы "Lachema". Концентрации холестерина (ХЛ) и триглицеридов (ТГ) определяли колориметрическим методом, основанным на определении концентрации вещества по интенсивности окраски раствором "наборы фирмы Vital-Diagnostic" (г. Санкт-Петербург). Активность фермента каталазы, определяли спектрофотометрически при длине волны 410 нм, выявляя способность образовывать стойкий окрашенный комплекс перекиси водорода с солями молибдена [5]. Маркером патологического процесса при развитии ДДИС в сыворотке крови являются уроновые кислоты (УК) [11].

Измеряли спектрофометрически при длине волны 540 нм против контроля (контроль и стандарт использован без гидролиза). Результаты определения ПОЛ и ОМБ были представлены в виде расчетного коэффициента суммы [ДК+МДА], [Альдегиды+Кетоны] и отношений [ДК/МДА], [Альдегиды/Кетоны].

Результаты исследования и обсуждение. Результаты, полученные при исследовании белкового и липидного спектра, а также показатели пероксидации в сыворотке крови животных в контрольной группе и при создании модели ДДИС представлены в таблице 1.

Таблица 1. Биохимические показатели уроновых кислот, липидного спектра и системы ПОЛ-АОС в сыворотке крови собак в норме и при моделировании остеоартроза на ранних стадиях развития ДДИС (медианы значений и интерквартильные размахи)

Показатель, ед.изм.	Контрольная группа (n = 10)	Опытная группа (n=14)
Уроновые кислоты, ммоль/л	4,40 (4,17;5,21)	6,20005 (5,00;6,39)
Общие липиды, г/л	3,36 (3,17;4,92)	4,79 (4,28;5,50)
Холестерин, ммоль/л	6,08 (4,05;6,23)	4,85 (3,76;6,41)
Триглицериды, ммоль/л	0,38 (0,36;0,43)	0,48 (0,43;0,54)
Диеновые конъюгаты, нмоль/г Ол	12,67 (6,75;20,46)	18,97°'05 (13,75;24,47)
Малоновый диальдегид, нмоль/г Ол	1,23 (1,12;2,54)	3,80005 (2,62;4,32)
Каталаза, мкатал/ г ОБ	1,41 (0,86;2,10)	1,29 (1,10;1,41)
ДК+МДА	15,58 (7,56;51,96)	74,95°'05(37,05;112,40)
ДК/МДА	10,30 (6,02;11,05)	5,98 (4,44;6,09)

Примечание: верхний индекс - уровень значимости (р) по сравнению с контрольной группой.

Показатель УК в сыворотке крови возрастал относительно тяжести дегенеративного процесса в суставе. Исследования показали, что при развитии ДДИС показатели ОЛ оставались на уровне значений контрольной группы. Также можно отметить, что все показатели липидов находились в пределах нормальных значений. Концентрации продуктов ПОЛ - имели статистически значимую тенденцию к повышению. Одним из неблагоприятных последствий ПОЛ считают образование МДА вследствие разрыва полиненасыщенных жирных кислот, обусловленного образованием свободных радикалов. Активность антиоксидантного фермента - каталазы не имела различий от контрольной группы. Расчетный коэффициент суммы продуктов ПОЛ [ДК+МДА], соответственно, был выше нормальных значений ввиду того, что происходило увеличение первичных и вторичных продуктов ПОЛ. Соотношение продуктов пероксидации липидов [ДК/МДА] не показало различий, то есть наблюдалось пропорциональное распределение продуктов ПОЛ.

Результаты сравнительной оценки показателей ОМБ в сыворотке крови экспериментальных животных приводим в таблице 2.

Таблица 2. Биохимические показатели ОМБ и состав белковых фракций в сыворотке крови собак в норме и при моделировании остеоартроза на ранних стадиях развития ДДИС (медианы значений и интерквартильные размахи)

Показатель, ед.изм.	Контрольная группа (n=10)	Опытная группа (n=14)
Общий белок, г/л	73,05 (71,22;75,92)	76,45 (75,15;79,85)
Альдегиды ОМБ, ед.опт. пл./ г ОБ	0,08 (0,06;0,09)	0,05005 (0,04;0,05)
Кетоны ОМБ, ед.опт. пл./ г ОБ	0,01 (0,01;0,01)	0,01 (0,01;0,01)
Альдегиды+Кетоны (10-3)	0,8 (0,6;1,10)	0,3005 (0,2;0,3)
Альдегиды/Кетоны	8,22 (6,34;9,01)	7,02 (6,19;8,69)
Белковые фракции: Альбумины, %	62,77 (59,75;63,68)	36,80005 (35,47;40,07)
агглобулины	5,06 (4,13;5,57)	3,00 (2,57;7,02)
а9-глобулины	9,10 (8,61;10,62)	14,95005(14,22;15,30)
р-глобулины	16,11 (12,60;17,54)	26,100001(23,92;28,87)
Y-глобулины	9,00 (8,06;9,09)	15,00005 (14,92;17,62)

Примечание: верхний индекс - уровень значимости (р) по сравнению с контрольной группой.

Отмечено, что у собак на ранних стадиях внутрисуставной патологии изучаемые показатели в сыворотке крови отличались от контрольной группы и имели свои особенности. Альдегиды ОМБ, в свою очередь, статистически значимо снижались с уровнем значимости р<0,05. Данный продукт образует с аминогруппами белка шиффовы основания, выступая при этом "сшивающим" агентом. В результате "сшивки" образуются нерастворимые "комплексы-пигменты" изнашивания или конечные продукты окисления внутри клеточных белков. Кетоны белков находились на дооперационном уровне. Рассмотрев расчетный коэффициент [Альдегиды+Кетоны], следует отметить его снижение, а соотношение [Альдегиды/Кетоны] не имело отличий от нормы. Состав белковых фракций сыворотки крови у экспериментальных животных с моделью ДДИС мы приводим также в таблице 2. Согласно полученным результатам анализа сыворотки крови на белковые фракции можно отметить, что мы наблюдали такой тип нарушения, как диспротеинемия. Снижение альбумина может быть связано с повышенной потерей белка. Это может быть обусловлено острым воспалением, а именно об этом говорит повышение концентрации фракции а2-глобулины. Повышение содержания фракции Y-глобулины непосредственно указывает на развитие дегенеративно-дистрофических изменений в суставах, особенно с экссудативным характером.

Таким образом, в сыворотке кроки экспериментальных животных с ранними стадиями ДДИС обнаружено статистически значимое повышение продуктов ПОЛ и превышение в 2 раза суммарной концентрации продуктов ПОЛ, но снижение в 1,5 раза продуктов ОМБ, что свидетельствует о дисбалансе продуктов пероксидации липидов и белков, накоплении свободно радикальных соединений липидной природы, которое приводит и способствует развитию патологических процессов в суставной полости.

Биохимические исследования сыворотки крови собак при моделировании остеоартроза на поздних стадиях показали значительные изменения в продуктах перокисдации липидов и липидного спектра,

что отражено в данных таблицы 3.

Таблица 3. Биохимические показатели уроновых кислот, липидного спектра и системы ПОЛ-АОС в сыворотке крови собак в норме и при моделировании остеоартроза на поздних стадиях ДДИС (медианы значений и интерквартильные размахи)

Показатель, ед.изм.	Контрольная группа (n = 10)	Опытная группа (n=6)
Уроновые кислоты, ммоль/л	4,40 (4,17;5,21)	6,48°'05 (5,33;6,61)
Общие липиды, г/л	3,36 (3,17;4,92)	14,48005(14,38±14,57)
Холестерин, ммоль/л	6,08 (4,05;6,23)	3,63005 (3,57;3,69)
Триглицериды, ммоль/л	0,38 (0,36;0,43)	0,710'05 (0,65;0,75)
Диеновые конъюгаты, нмоль/г Ол	12,67 (6,75;20,46)	1,58005 (1,51;1,63)
Малоновый диальдегид, нмоль/г Ол	1,23 (1,12;2,54)	0,95 (0,69;1,19)
Каталаза, мкатал/ г ОБ	1,41 (0,86;2,10)	1,10 (1,05;1,15)
ДК+МДА	15,58 (7,56;51,96)	1,50005 (1,04;1,93)
ДК/МДА	10,30 (6,02;11,05)	2,43001 (1,71;3,14)

Примечание: верхний индекс - уровень значимости (р) по сравнению с контрольной группой.

Приведенные данные по концентрации УК позволяют говорить о разрушении органического матрикса суставных поверхностях при поздних, далеко зашедших стадиях остеоартроза, независимо от его генеза. Мы не отметили возрастания концентрации ОЛ на ранних стадиях, а на поздних стадиях концентрация ОЛ статистически значимо превышает нормальные значения в 4 раза. Изменение липидного спектра отражено в снижении концентрации ХЛ и повышении концентрации ТГ

На ранних стадиях концентрация первичных продуктов ПОЛ- ДК-имела тенденцию к повышению, также как и концентрация вторичных

продуктов ПОЛ- МДА- была статистически значимо выше нормы. На поздних стадиях развития заболевания продукты ПОЛ как первичные, так и вторичные были ниже нормы. Активность каталазы определялась без статистически значимых изменений.

Биохимические показатели ОМБ и состав белковых фракций в сыворотке крови собак на поздних стадиях развития заболевания представлены в таблице 4.

Таблица 4. Биохимические показатели ОМБ и состав белковых фракций в сыворотке крови собак в норме и при моделировании остеоартроза на поздних стадиях ДДИС (медианы значений и интерквартильные размахи)

Показатель, ед.изм.	Контрольная группа (n=10)	Опытная группа (n=6)
Общий белок, г/л	73,05 (71,22;75,92)	80,55 (79,85;81,27)
Альдегиды ОМБ, ед.опт. пл./ г ОБ	0,08 (0,06;0,09)	0,05005 (0,04;0,06)
Кетоны ОМБ, ед.опт.пл./ г ОБ	0,01 (0,01;0,01)	0,01 (0,01;0,01)
Альдегиды+Кетоны (10-3)	0,8 (0,6;1,10)	0,5005 (0,4;0,6)
Альдегиды/Кетоны	8,22 (6,34;9,01)	4,50005 (4,25;4,75)
Белковые фракции: Альбумины %	62,77 (59,75;63,68)	30,23005(27,99;32,33)
а^глобулины	5,06 (4,13;5,57)	2,64001 (2,35;3,00)
а2-глобулины	9,10 (8,61;10,62)	15,59005(14,02;17,31)
р-глобулины	16,11 (12,60;17,54)	29,32005(28,47;29,82)
у-глобулины	9,00 (8,06±9,09)	15,22001(15,10;15,34)

Примечание: верхний индекс - уровень значимости (р) по сравнению с контрольной группой.

Результаты исследований, проведенных нами в сыворотке крови собак, показали, что концентрация ОБ оставалась на уровне контрольных значений. Концентрация продуктов ОМБ статистически значимо понижалась только в альдегидах, концентрация кетонов оставалась без изменений. Соответственно, в виду снижения концентрации альдегидов ОМБ были снижены и расчетный коэффициент [Альдегиды+Кетоны], и соотношение [Альдегиды/Кетоны]. Снижалось процентное содержание фракции а1-глобулинов. Существенные изменения наблюдались в содержании а2-глобулиновой, р-глобулино-вой и Y-глобулиновой фракций, которые были статистически значимо выше нормальных значений. На ранних стадиях мы наблюдали только повышение содержания фракции Y-глобулинов.

Полученные нами результаты показывают статистически значимые изменения в составе сыворотки крови собак на поздних стадиях развития патологического процесса, а именно: увеличение в 4 раза концентрации ОЛ, изменение липидного спектра с двукратным повышением значений ТГ и снижением концентрации ХЛ в 2 раза. Кроме того, отмечено значительное (в 8 раз) понижение концентрации ДК, и некоторое (на 23%) - МДА, чего мы не наблюдали при развитии остеоартроза на ранних стадиях. В ОМБ были снижены только концентрации альдегидов ОМБ, что было отмечено и на ранних стадиях ОА. Статистически значимое возрастание концентраций а2-глобулиновой, р-глобулиновой и Y-глобулиновой фракций указывает на наличие воспалительного процесса и хронической формы заболевания.

Список литературы:

1. Борисов М.С. Диагностика, лечение, профилактика закрытых и открытых повреждений суставов и сухожилий у животных: автореф. дис. ... д-ра вет. наук: 16.00.05 / Борисов Михаил Семенович. - М., 2001. - 43 с.
2. Вьюшин А.В. Процессы перекисного окисления белков у крыс, селективных по порогу возбудимости нервной системы / А.В. Вьюшин, А.И. Вайдо, И.А. Герасимова // Бюл. эксперимент. биологии и медицины. - 2002. - Т. 133, 19 № 3. - С. 292-296.
3. Давыдов В.Б. Методы экспериментального моделирования остеоартрозов у мелких экспериментальных животных / В.Б. Давыдов. ULR: http://www.allvet.ru/modules/articles/article.php?id=31 (дата обращения 25.07.2010).
4. Дедух Н. В. Метод морфологической оценки сустава при деструктивнодистрофических поражениях: информ. письмо / Н.В. Дедух, С.В. Малышкина, Е.Я. Панков. - Киев., 1988. - 2 с.
5. Королюк М.А. Метод определения активности каталазы / М.А. Коро-люк, Л.И. Иванова, В.Е. Токарев // Лаб. дело. - 1988. - № 1. - С. 16-19.
6. Моделирование остеоартроза коленного сустава у собак / В.Д. Маку-шин, М.А. Степанов, Т.А. Ступина // Биомедицина. - 2012. - №3. - С.108-115.
7. Орехович В.Н. Современные методы в биохимии / В.Н. Орехович. - Медицина, 1977. - С. 392.
8. Патент 2452999 Р.Ф, МПК Способ моделирования остеоартроза коленного сустава / Макушин В.Д. (РФ), Степанов М.А. (РФ), Ступина Т.А. (РФ), РНЦ "ВТО" им. акад. Г.А. Илизарова (РФ). - №2011104885/14; Заявл. 09.02.2011.; Опубл. 10.06.2012. Бюл.№16.
9. Шевцов В.И. Моделирование суставной патологии путем иммобилизации суставов аппаратом Илизарова: тез. докл. итоговой научно-практ. конф. НИЦТ "ВТО" / В.И. Шевцов, С.Н. Асонова, Л.И. Грачева. - Казань, 1994. - С. 35.
10. Ягников С.А. Консервативное лечение остеоартроза крупных суставов у собак / С.А. Ягников, В.Н. Митин // Вестник ветеринарной медицины. -2004. - № 1. - С. 7-11.
11. Bitter T A modified uronic acid carbazole reaction / T Bitter, H.M. Muir // Anal. Biochem. -1962. -N. 4. - P. 330 - 334.

Резюме. На взрослых беспородных собаках проводили экспериментальное моделирование остеоартроза путем иммобилизации обоих коленных суставов аппаратом Илизарова с пересечением бедренной артерии. Основным материалом исследования являлась сыворотка крови 30-ти беспородных собак: интактных (n=10), с моделью ДДИС (n=20) на ранних стадиях (28 суток n=14) и с моделью дегенеративных изменений в суставах на поздних стадиях заболевания (56 суток n=6). Сроки эксперимента определяли по клинико-рентгенологической характеристике состояния суставов. Изучали биохимические показатели сыворотки крови на разных стадиях патологического процесса. Цель исследования - изучение изменений перекисного окисления липидов (ПОЛ) и окислительной модификации белков (ОМБ) у экспериментальных животных на разных стадиях развития дегенеративно-дистрофических изменений в суставах (ДДИС). Результаты данного исследования показывают статистически значимые изменения в составе сыворотки крови собак на разных стадиях развития патологического процесса. Отмечено, что на поздних стадиях развития заболевания происходит понижение концентраций первичных и вторичных продуктов липопероксидации, чего не наблюдали при развитии остеоартроза на ранних стадиях. В продуктах окислительной модификации белков были снижены концентрации альдегидов белков, как на ранних, так и на поздних стадиях патологического процесса. Статистически значимое возрастание концентраций а2-глобулиновой, р-глобулиновой и у-глобулиновой фракций указывает на наличие воспалительного процесса и хронической формы заболевания. Полученные результаты исследования могут быть использованы для ранней диагностики патологического процесса в крупных суставах, и служить дополнительной информацией при постановке диагноза.

Ключевые слова: собаки, остеоартроз, перекисное окисление липидов, окислительная модификация белков, дегенеративно-дистрофические изменения в суставах, сыворотка крови, диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид, общий белок, общие липиды, альдегиды, кетоны.

Сведения об авторах:

Спиркина Елена Сергеевна, лаборант-исследователь лаборатории биохимии ФГБУ "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. ГА. Илизарова" Минздравсоцразвития России; 640014, Курган, ул. М. Ульяновой, д. 6; тел.: 8 (3522) 45-05-38; е-mail: spirkina.82@mail.ru.

Матвеева Елена Леонидовна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии ФГБУ "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. ГА. Илизарова" Минз-дравсоцразвития России; 640014, Курган, ул. М. Ульяновой, д. 6; тел.: 8 (3522) 45-05-38; e-mail: matveevan@mail.ru.

Гасанова Анна Георгиевна, младший научный сотрудник лаборатории биохимии ФГБУ "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. Г.А. Илизарова" Минздравсоцразвития России; 640014, Курган, ул. М. Ульяновой, д. 6; тел.: 8 (3522) 45-05-38; е-mail: gasanova08@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Степанов Михаил Александрович, ведущий научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук, ветеринарный врач лаборатории гнойной остеологии и замещения дефектов конечностей ФГБУ "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. Г.А. Илизарова" Минздравсоцразвития России; 640014, Курган, ул. М. Ульяновой, д. 6; тел.: 8 (3522) 45-46-36; е-mail: m-stepanov@mail.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей