Эффективность применения пептидного биорегулятора сосудов для коррекции ориентировочно-исследовательского поведения у гипертензивных животных

УДК 636.028

Соколова И.Б. ФГБУ Институт физиологии имени И.П. Павлова РАН, г. Санкт-Петербург
Федотова О.Р. ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт
прикладных проблем», г. Санкт-Петербург

Введение. С развитием методов измерения кровяного давления у домашних животных и с повышением их продолжительности жизни артериальная гипертензия (далее, АГ) стала выходить на ведущие роли в истории болезни кошек и собак среднего и пожилого возраста. Доказано, что АГ приводит к морфологическим, метаболическим, биохимическим изменениям в тканях большинства органов, в том числе и в головном мозге [1]. В свою очередь, патологические изменения в центральной нервной системе являются основной причиной когнитивных, двигательных, поведенческих и эмоциональных нарушений. Разработка новых методов лечения АГ - важнейшая задача современных медицины и биологии. Проводить экспериментальные исследования целесообразнее на лабораторных, а не на домашних животных. Спонтанно гипертензивные крысы линии SHR являются моделью для изучения АГ. По мере развития АГ, у этих животных выявляются изменения в нейромедиаторных системах головного мозга (дофаминэргической, холинэргической, норадренэргической), которые участвуют в формировании и регулировании двигательной и исследовательской активности, внимания, запоминания [8, 9, 10].

Пептидный биорегулятор сосудов (ПБС) обладает ангиопротектив-ными свойствами [11]. Его применение при АГ способствует восстановлению микрососудистого русла и основных параметров микроциркуляции в головном мозге практически до уровня нормотензивных животных [4].

Цель исследования стало изучение эффективности применения пептидного биорегулятора сосудов для коррекции ориентировочно-исследовательского поведения при развитии артериальной гипертензии в течение года.

Материалы и методы исследования. Эксперименты проведены на спонтанно гипертензивных крысах-самцах линии SHR. Животных содержали в стандартных условиях вивария при естественном освещении и свободном доступе к воде и пище. Исследования проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», принятых Европейской конвенцией 19.07.2014.

Пептидный биорегулятор сосудов Славинорм®, разработанный в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии, представляет собой комплекс полипептидов с молекулярной массой от 72 до 678 Да, экстрагированных из сосудов телят. В фармакопейной статье предприятия (ФСП) на лекарственный препарат Славинорм® действующее вещество обозначено следующим образом: полипептиды сосудов крупного рогатого скота.

Для представленного экспериментального исследования было сформировано 5 групп крыс-самцов линии SHR (табл. 1).

Таблица 1 Экспериментальные группы спонтанно гипертензивных животных

Группа экспериментальных животных	Среднее артериальное давление (мм рт. ст.)
1. Интактные крысы SHR в возрасте 4 мес	176±2,4 (n=6)
2. Интактные крысы SHR в возрасте 6 мес	185,6±5,2 (n=6)
3. Крысы SHR в возрасте 6 мес, которым за 2 мес до исследования (в возрасте 4 мес) был проведен один курс ПБС	182,6±3,4 (n=14)
4. Интактные крысы SHR в возрасте 12 мес	190,7±3,3 (n=6)
5. Крысы SHR в возрасте 12 мес, которым было проведено 2 курса ПБС: первый - в возрасте 4 мес; второй - в возрасте 10 мес (за 2 месяца до исследования)	191,1±3 (n=14)

Все курсы ПБС (0,25 мг) осуществляли внутримышечно по схеме: одна инъекция в сутки в течение 5 дней, перерыв двое суток, одна инъекция в сутки в течение 5 дней, всего 10 инъекций на курс.

Среднее артериальное давление (далее, АД) измеряли с помощью устройства для неинвазивного измерения АД у ненаркотизированных крыс, изготовленного в экспериментальных мастерских Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Оценку поведения крыс линии SHR в возрасте 4, 6 и 12 месяцев проводили в установке «Открытое поле» («ОП», модель TS 0501, НПК «Открытая Наука»). Установка представляет собой арену (d=97 см), ограниченную непрозрачными бортами высотой 42 см, с 12 равномерно расположенными отверстиями в полу (d=2 см). Животное помещали в центр поля и в течение 3 мин регистрировали количество и последовательность всех поведенческих актов с помощью оригинальной программы «open field». Идентификацию актов проводили на основании классификации индивидуального поведения в «ОП»: «локомоция» - поступательное движение тела в горизонтальной плоскости; «обнюхивание» - принюхивание; «движение на месте» - повороты головы без существенных изменений координат корпуса в горизонтальной и вертикальной плоскостях; «груминг» - облизывание тела; «стойка с упором» - стойка на задних лапах с опорой на борта установки; «вертикальная стойка» - стойка на задних лапах в отдалении от бортов; «норка» - заглядывание в норку; «сидит» - неподвижность животного, обычно в позе сидя с подогнутыми конечностями и сгорбленной спиной [3].

У животных оценивали двигательную активность (количество актов «локомоция», «движение на месте», «сидит»), ориентировочно-исследовательское (количество актов «обнюхивание», «норка», «вертикальная стойка», «стойка с упором») и эмоциональное поведение (количество актов «груминг», «движение на месте», «вертикальная стойка»).

При статистической обработке достоверность различий двух выборок оценивали при помощи непараметрического U-критерия Манна-Уитни (программа Statistica v. 8) с уровнем достоверности (p<0,05) [2]. 25

Результаты исследований и их обсуждение. Паттерны поведения в тесте «ОП» у крыс линии SHR в возрасте от 4 до 6 месяцев представлены на рисунке 1.

Рис. 1. Поведение спонтанно гипертензивных крыс в возрасте 4 и 6 месяцев в тесте «Открытое поле» (серая заливка - интактные SHR в возрасте 4 месяцев; черно-белая заливка - интактные SHR в возрасте 6 месяцев; черная с белыми точками - SHR в возрасте 6 месяцев, которым за 2 месяца до исследования (в возрасте 4 месяцев) был проведен один курс пептидного биорегулятора; по вертикальной оси - среднее количество актов поведения (± ошибка среднего); по горизонтальной оси -акты поведения; количество акта «сидит» во всех группах равно нулю; * - статистически значимые различия между группами животных (p < 0,05))

Показатели поведения в тесте «ОП» у интактных 6-месячных крыс SHR по сравнению с 4-месячными статистически достоверно снизились: в среднем в 1,2 раза уменьшилось количество акта «локомоция», что свидетельствует о снижении двигательной активности; количество актов «обнюхивание», «норка», «вертикальная стойка» и «стойка с упором» у животных в возрасте 6 месяцев также стало меньше в среднем в 1,1, 1,4, 2,3 и 9 раз, соответственно, то есть исследовательская мотивация и ориентировочное поведение угасали. По литературным данным, поведенческие нарушения у крыс линии SHR были зафиксированы уже в возрасте первых 4-10 недель жизни, когда АД еще практически не отличалось от такового у нормотен-зивных животных [7]. Повышение АД у крыс SHR фиксировали в возрасте примерно 6 недель. До 4 месяцев у данных животных не были выявлены морфологические изменения сосудистого русла головного мозга [12]. Иммуногистохимические исследования показали, что по мере взросления в стенке артерий неокортекса повышается иммунореактивность маркеров, указывающих на деградацию внеклеточного матрикса и замещение мышечных клеток коллагеновыми волокнами [6]. Вероятно, ухудшение мозгового кровообращения у 6-месячных SHR по сравнению с 4-месячными является одной из причин ухудшения ориентировочно-исследовательского поведения животных.

Применение одного курса пептидного биорегулятора Слави-норм® привело к статистически значимому увеличению количества актов: «локомоция» в среднем в 1,17 раза, «вертикальная стойка» - в 1,75 раза, «стойка с упором» - в 4 раза, «груминг» - на 50%. Мы предполагаем, что улучшение ориентировочно-исследовательского поведения крыс SHR после курса ПБС связано со значительным увеличением плотности микрососудистой сети, перфузии и тканевой сатурации кислородом в сенсомоторной коре головного мозга, как было показано в наших предыдущих работах [5]. Сенсомоторная кора (зоны передней теменной и собственно теменной области) является зоной представительства афферентации кожно-кинэстетического анализатора, ведущего в формировании приспособительных реакций грызунов. Следовательно, улучшение микроциркуляции в данной зоне головного мозга будет способствовать активации ориентировочно-исследовательского поведения гипертензивных животных. Однако, снижение количества актов вертикального поведения («вертикальная стойка», «стойка с упором») на фоне увеличения количества актов «движения на месте» и отсутствия акта «груминг» свидетельствует о негативном эмоциональном состоянии животных. У крыс один курс пептидного биорегулятора Славинорм® в большей степени нивелировал отрицательное эмоциональное поведение.

По литературным данным, к возрасту 12 месяцев у крыс линий SHRSP и SHR структура стенки мозговых артериол, артерий и крупных магистральных артерий (включая аорту) претерпевает существенные морфологические изменения - нарушается целостность эндотелиального слоя, часть эндотелиальных клеток погибает, у других наблюдаются деструктивные изменения. В результате у гипертензивных животных развивается эндотелиальная дисфункция [13]. Тем не менее, мы не наблюдали значимого ухудшения ориентировочноисследовательского поведения у крыс SHR в возрасте от 6 до 12 месяцев (рисунок 2 ).

Рис. 2. Поведение спонтанно гипертензивных крыс в возрасте 6 и 12 месяцев в тесте «Открытое поле» (серая заливка - интактные SHR в возрасте 6 месяцев; черно-белая заливка - интактные SHR в возрасте 12 месяцев; черная с белыми точками - SHR в возрасте 12 месяцев, которым за 2 месяца до исследования (в возрасте 10 месяцев) был проведен один курс пептидного биорегулятора; по вертикальной оси - среднее количество актов поведения (± ошибка среднего); по горизонтальной оси - акты поведения; количество акта «сидит» во всех группах равно нулю; * - статистически значимые различия между группами животных (p < 0,05))

Однако, количество акта «вертикальная стойка» уменьшилось примерно в 4 раза. После второго курса ПБС статистически значимо увеличилось количество актов: «вертикальная стойка» в среднем в 3 раза, «стойка с упором» - в 3 раза, «груминг» - в 2,8 раза. Повторный курс ПБС привел к увеличению плотности микрососудистой сети пиальной оболочки сенсомоторной коры у 12-месячных крыс по сравнению с интактными животными той же возрастной категории (в среднем в 1,6-1,7 раза), статистически значимому повышению таких показателей микроциркуляции в сенсомоторной коре, как перфузия и сатурация кислородом (табл. 2) [5].

Вероятно, даже на поздней стадии развития АГ применение ПБС для коррекции изменений ориентировочно-исследовательского поведения оказывается достаточно эффективным.

Итак, применение ПБС эффективно для улучшения мозговой микроциркуляции и коррекции ориентировочно-исследовательского поведения гипертензивных крыс на разных стадиях АГ. Результаты, полученные на грызунах, могут быть интерпретированы на другие виды домашних животных. Применение ПБС достаточно просто и может быть осуществлено в домашних условиях.

Таблица 2 Основные показатели микроциркуляции в сенсомоторной коре головного мозга спонтанно гипертензивных животных [5]

Показатели микроциркуляции	Интактные крысы SHR в возрасте 6 месяцев	Крысы SHR в возрасте 6 месяцев, которым за 2 месяца до исследования (в возрасте 4 месяцев) был проведен один курс ПБС	Интактные крысы SHR в возрасте 12 месяцев	Крысы SHR в возрасте 12 месяцев, которым было проведено 2 курса ПБС: первый - в возрасте 4 месяцев; второй - в возрасте 10 месяцев (за 2 месяца до исследования)
Плотность микрососудистого русла (количество микрососудов на единицу площади)	35,3±1,1	43,9±2,4	33,3±1,1	53,8±0,9
Перфузия - показатель тканевой микроциркуляции, измеренный методом лазерной допплеровской флуометрии (перф. ед.)	23,8±1,3	25,1±1,1	24±0,6	27,5±1,1
Сатурация ткани кислородом, измеренная методом оптической тканевой оксиметрии (%)	97,8±0,4	96,5±0,3	96,1±0,3	97,8±0,3

Работа выполнена с использованием животных из биоколлекции ИФ РАН.

Авторы благодарят директора Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии член-корреспондента РАН В.Х. Хавинсона и его сотрудников за предоставление пептидного биорегулятора сосудов для проведения экспериментальных исследований.

Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных научных исследований государственных академий на 2014-2020 годы (ГП-14, раздел 64).

Список литературы.

1. Верещагин Н.В., Моргунов В.А., Гулевская Т.С. Патология головного мозга при атеросклерозе и артериальной гипертонии. - М.: «Медицина». - 1997. - 275 с.
2. Гланц С. Микробиологическая статистика. - М.: «Практика». - 1999. - 459 с.
3. Петров Е.С. Изучение нейробиологических основ сложных безусловных рефлексов в Физиологическом отделе им. И.П. Павлова: итоги последних лет. - Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 1990. - Том 76. - № 12. - С. 1669-1681.
4. Соколова И.Б., Сергеев И.В., Рыжак Г.А., Хавинсон В.Х., Козина Л.С. Влияние пептидного биорегулятора сосудов на микроциркуляцию в коре головного мозга старых крыс с артериальной гипертензией. - Успехи геронтологии. - 2017. - Том 30. - № 4. - С. 534-537.
5. Соколова И.Б., Рыжак Г.А., Хавинсон В.Х. Функциональная кумуляция влияния пептидного биорегулятора сосудов на микроциркуляцию в коре головного мозга у спонтанно гипертензивных крыс. - Успехи геронтологии. - 2017. - Том 30. - № 5. - С. 671-675.
6. Bailey E., Wardlaw J., Graham D., Dominiczak A., Sudlow C., Smith C. Cerebral small vessel endothelial structural changes predate hypertension in stroke-prone spontaneously hypertensive rats: a blinded? Controlled immunohistochemical study of 5- to 21-week-old rats. - Neuropathology and Applied Neurobiology. - 2011 (37). - P. 711-726.
7. Buuse M., Jong W. Open-field behavior and blood pressure in spontaneously hypertensive rats. - Clin Exp Hypertens A. - 1988. - V. 10 (4). - P. 667-684.
8. Gattu M., Pauly J., Boss K., Summers J., Buccafusco J. Cognitive impairment in spontaneously hypertensive rats: role of central nicotinic receptors. - Brain Res.- 1997. - V. 771 (1). - P. 89-103.
9. Grunblatt E., Bartl J., Iuhos D., Knezovic A., Trkulja V., Riederer P., Walitza S., Salkovic-Petrisic M. Characterization of cognitive deficits in spontaneously hypertensive rats, accompanied by brain insulin receptor dysfunction. - J MP. - 2015. - V. 3 (6). - P. 1-10.
10. Ko I., Kim S., Kim T., Ji E., Shin M., Kim C., Hong M., Bahn G. Swimming exercise alleviates the symptoms of attention-deficit hyperactivity disorder in spontaneous hypertensive rats. - Mol Med Reports. - 2013 (8). - P. 393-400.
11. Ryzhak A. P., Kuznik B. I., Rutkovskaya V. N., Ryzhak G. A. The antiatherosclerotic effects of a geroprotector peptide. - Advances in gerontology. -2012. - V. 2 (4). - P. 332-335.
12. Tayebati S., Tommasssoni D., Amenta F. Spontaneously hypertensive rat as a model of vascular brain disorder: microanatomy, neurochemistry and behavior. - J Neurol Scin. - 2012. - V. 322 (1-2). - P. 244-249.
13. Wallace S.M., Yasmin C., McEniery C., Maki-Petaja K., Booth F.A., Cockcroft J., Wilkinson I. Isolated systolic hypertension is characterized by increased aortic stiffness and endothelial dysfunction. - Hypertension. - 2007 (50). - P. 228-233.

Резюме. Разработка новых методов лечения артериальной гипертонии - важнейшая задача современных медицины и биологии. Авторами была исследована эффективность применения пептидного биорегулятора сосудов для коррекции изменений ориентировочно-исследовательского поведения, происходящих при развитии артериальной гипертензии. Эксперименты проводились на спонтанно гипертензивных крысах-самцах линии SHR в возрасте от 4 до 12 месяцев. Оценку поведения крыс линии SHR проводили в установке «Открытое поле». Авторами показано, что артериальная гипертензия приводит к угасанию двигательной функции и исследовательской мотивации. С 4 до 6 месяцев уменьшилось количество актов «локомоция», «обнюхивание», «норка», «вертикальная стойка» и «стойка с упором» в среднем в 1,2, 1,1, 1,4, 2,3 и 9 раз, соответственно. С 6 до 12 месяцев не наблюдали значимого ухудшения ориентировочно-исследовательского поведения у крыс SHR. С помощью пептидного биорегулятора сосудов удалось восстановить количество основных поведенческих актов у гипертензивных животных в установке «Открытое поле» как в возрасте 6 («локомоция» в 1,17 раза, «вертикальная стойка» в 1,75 раза, «стойка с упором» в 4 раза, «груминг» на 50%), так и 12 месяцев («вертикальная стойка» в 3 раза, «стойка с упором» в 3 раза, «груминг» в 2,8 раза). Авторы считают, что улучшение ориентировочно-исследовательского поведения крыс SHR после курса применения пептидного биорегулятора сосудов связано со значительным увеличением плотности микрососудистой сети, перфузии и тканевой сатурации кислородом в сенсомоторной коре головного мозга. Результаты, полученные на грызунах, могут быть интерпретированы на другие виды домашних животных.

Ключевые слова: артериальная гипертензия, спонтанно гипертензивные крысы, пептидный биорегулятор сосудов, ориентировочно-исследовательское поведение, тест «Открытое поле».

Сведения об авторах:

Соколова Ирина Борисовна, старший научный сотрудник Института физиологии им. И.П. Павлова РАН; 199034, г. Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6; тел.: 8-813-7071553; e-mail: sokolovaib@infran.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Федотова Ольга Ростиславовна, начальник сектора ФГУП «Научно-исследовательский институт прикладных проблем»; 191167, г. Санкт-Петербург, наб. Обводного канала, 29; тел.: 8-812-4067410 (доб. 2-417-1); e-mail: fedot2003@mail.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей