Ориентировочный метод определения чувствительности микроорганизмов к комплексным антибактериальным препаратам

УДК 619:618.19-002:636.22/28
DOI 10.33861/2071-8020-2021-2-34-36

Авдуевская Н.Н., Семина Л.К., Скулябина З.А. Вологодский филиал Федерального государственного
бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский
институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко
Российской академии наук», г. Вологда

Введение. Мастит - воспалительный процесс в тканях молочной железы. Воспаление является сложной реакцией организма, возникающей в ответ на действие механических, термических, химических или биологических факторов. Поэтому развитие, течение и исход мастита зависит от состояния организма и условий его существования, от состояния тканей молочной железы и характера болезнетворных факторов, в частности от патогенности микробов и путей проникновения их в молочную железу [3].

В ветеринарной практике для лечения мастита всё чаще применяют комплексные антибактериальные лекарственные препараты для интрацистернального введения, включающие в свой состав один, два и более антибиотиков.

Основная цель комбинированной антибиотикотерапии - достижение синергидного эффекта и расширение спектра антибактериальной активности в отношении множественно устойчивых патогенов. Комбинированная терапия широко используется для лечения инфекций, вызванных панрезистентными грамотрицательными возбудителями, или возбудителями, сохраняющими чувствительность только к одному из антибиотиков [6].

Комбинации такого рода преследуют цели повышения противомик-робного действия и ослабления отрицательного влияния их. При комбинированном назначении нескольких веществ с разным механизмом действия нарушают одновременно несколько звеньев метаболизма у возбудителей болезней, поэтому надежнее и быстрее вызывают гибель их. Усилить действие можно при сочетании вещества сильно, но кратковременно действующего, с умеренным по силе, но долго действующим. При этом первое вещество если не убивает, то переводит возбудителя болезни в анабиотическое состояние, а второе вещество мешает выйти ему из такого состояния [7].

Микробиологическая эффективность комбинаций антибиотиков трудно прогнозируема в связи с возможным присутствием у микроорганизма разнообразных механизмов резистентности даже к препаратам из одной группы. Поэтому для подбора эффективных комбинаций антибиотиков требуется проводить микробиологическое тестирование изолятов [6].

Общеизвестно, что в связи с появлением и широким распространением антибиотикорезистентности у бактерий необходимо определять чувствительность микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний животных к антимикробным препаратам.

Однако в ветеринарной медицине проведение вышеуказанного исследования применяют в основном не к препаратам комбинированного типа, которые используются для лечения мастита коров, а непосредственно к определенному антибиотику (действующему веществу).

Считаем, что это не позволяет более рационально проводить анти-биотикотерапию против воспаления молочной железы коров и в связи с этим мы апробировали диско-диффузионный метод определения чувствительности выделенных из молока коров микроорганизмов применительно к комплексным антимикробным препаратам.

Материалы и методы исследований. Микробиологическим исследованиям был подвергнут секрет молочной железы больных маститом коров из тринадцати сельскохозяйственных предприятий Вологодской, Ярославской и Костромской областей.

Исследования проводились в соответствии с «Методическими указаниями по бактериологическому исследованию молока и секрета вымени коров» [4], идентификация выделенных микроорганизмов -согласно ГОСТ 30347-2016 «Молоко и молочная продукция. Метод определения Staphylococcus aureus» [2] с использованием плазмы кроличьей цитратной сухой (ЗАО «Эколаб») и набора реагентов для выявления стрептококков групп А, В, С, G, D, F (ООО «НПО Аквапаст»).

Определение чувствительности выделенных из молока микроорганизмов к комплексным препаратам осуществлялось согласно «Методическим указаниям по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» [5], в качестве носителя антимикробного средства использовали бумажный диск, пропитанный в препарате комплексного антимикробного действия. Математическая обработка полученных результатов проводилась с помощью методического руководства «Биометрическая обработка лабораторных, клинических и эпизоотологических данных» [1].

Результаты исследований и их обсуждение. В результате микробиологических исследований секрета вымени лактирующих коров, отобранных в тринадцати животноводческих хозяйствах Вологодской, Ярославской, Костромской областей, из 269 проб исследуемого молока было изолировано 216 культур патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а также молочнокислой и прочей непатогенной флоры.

Анализ результатов микробиологических исследований молока (секрета вымени) из указанных выше хозяйств показал, что за 2020 год в спектре выделенной микрофлоры патогенная и условно-патогенная флора составила 85 культур (31,6%), молочнокислая и прочая непатогенная - 131 культуру (48,7%).

В исследованиях по оценке антибиотикочувствительности применяли чистые культуры микроорганизмов: 11 штаммов золотистого стафилококка, 6 штаммов условно-патогенных стафилококков, 6 штаммов энтеробактерий и 4 штамма агалактийного стрептококка, выделенных из секрета вымени коров. В качестве комплексных антимикробных препаратов использовали 36 шприцев для внутривымянного введения, содержащих один, а также два и более антибиотиков (табл. 1).

Чувствительность указанных выше микроорганизмов к антибактериальным препаратам определяли диско-диффузионным методом. В нашем случае данный метод не позволяет оценивать результат по критериям для стандартных дисков и является ориентировочным в выборе того или иного препарата для лечения больных маститом коров. Он включает в себя последовательное выполнение нескольких этапов: приготовление питательных сред, приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов, инокуляция, инкубация, наложение бумажных дисков, пропитанных в комплексных антибактериальных препаратах, на плотную питательную среду, учёт и интерпретация результатов.

Выполнение этапа бумажных дисков проводили следующим образом. Стерильные бумажные диски из фильтровальной бумаги диаметром 6 мм пропитывали в капле комплексного антимикробного препарата в течение 18-24 часов. Для каждого препарата использовали отдельный диск. После пропитывания бумажные диски подсушивали с помощью фильтровальной бумаги с целью удаления излишнего количества суспензии препарата.

Далее пропитанные и подсушенные бумажные диски выкладывали на чашку Петри с агаром с предварительно подготовленной и нанесенной на них суспензией исследуемых микроорганизмов (через 20-25 минут). Аппликацию дисков проводили с помощью стерильного пинцета, соблюдая расстояние 15-20 мм от диска до края чашки и между дисками.

Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри помещали в термостат кверху дном и инкубировали при температуре 37°С в течение 18-24 часов.

После окончания инкубации учитывали результаты, измеряя диаметр зон задержки роста, ориентируясь на зону полного подавления видимого роста (рисунок 1). Исходя из наибольшей зоны задержки роста, рекомендовали препараты для использования в каждом конкретном хозяйстве (ферме).

Таблица 1 Наименование комплексных препаратов для лечения мастита лактирующих коров

Содержат одно действующее вещество (антибиотик)	Содержат два и более действующих веществ (антибиотиков)
1. Кобактан (цефкином)	1. Анкопен П (бензилпенициллин, канамицин)
2. Мастикам (амоксициллин)	2. Ваккамаст (диоксидин, линкомицин)
3. Мастиет голд (цефаперин)	3. Гамарет (новобиоцин, неомицин, бензилпенициллин, септомицин)
4. Нороклав (амоксициллин)	4. Диеномаст (диоксидин, гентамицин)
5. Норфлоксамаст (норфлоксацина никотинат)	5. Лактобай (клоксациллин, ампициллин)
6. Синулокс (амоксициллин)	6. Максифо LC (неомицин, новобиоцин, пенициллин, дигидростептомицин)
7. Ц-маст (цефазолин)	7. Мамикур (клоксациллин, неомицин)
8. Энроутеромаст ВБФ (энрофлоксацин)	8. Мастиет форте (тетрациклин, неомицин, бацитрацин)
9. Амокслав (амоксициллин)	9. Мастинон форте (окситетрациклина гидрохлорид, неомицина сульфат, бацитрацин)
10. Цефурокс (цефуроксим натрия)	10. Мастивекс (неомицин, сульфадимедин)
11. Амоксибаг (амоксициллин)	11. Мастивин (метилурацил, рифампицин, гентамицин)
12. Колимаст (неомицин)	12. Мастилек (бензилпенициллин, стрептомицин, неомицин)
	13. Мастимакс (бензилпенициллин, дигидрострептомицин, неомицин, диоксидин)
	14. Мастилекс (цефалексин, гентамицин)
	15. Мастомицин (гентамицин, клиндамицин)
	16. Мастолексин (цефалексина моногидрат, гентамицина сульфат)
	17. Мультибай (пенициллин, стрептомицин, неомицин)
	18. Мультиджект (пенициллин, стрептомицин, неомицин)
	19. Прималакт (цефатаксим, неомицин)
	20. Тетра дельта (новобиоцин, неомицин, пенициллин, септомицин)
	21. Тиломаст (тилозина тартрат, неомицин, бацитрацин)
	22. Интрамаст (клоксациллин, ампициллин)
	23. Мак Д3 (спирамицин, гентамицин, флуметазон)
	24. Тетраантимаст (новобиоцин, неомицин, пенициллин, дигидрострептомицин)

В ходе работы мы определили среднюю зону задержки роста золотистого стафилококка на примере семи хозяйств и часто используемых комплексных антибактериальных препаратов (табл. 2).

Таблица 2 Зона задержки роста золотистого стафилококка к комплексным антимикробным препаратам

Наименование комплексного препарата	Номера хозяйств/ ЗЗР золотистого стафилококка, мм							M±m	Изменчивость по хозяйствам, (CV)%
	1	2	3	4	5	6	7
1. Диеномаст	22	24	16	25	30	20	28	23,5±0,09	19,7
2. Норфлоксамаст	31	41	27	32	33	30	32	32,2±0,09	14,3
3. Синулокс	30	43	30	40	29	30	25	32,4±0,09	18,3
4. Мастинон форте	30	32	26	30	28	27	25	28,2±0,12	8,1
5. Прималакт	28	28	30	30	30	24	27	28,1±0,12	7,0
6. Мастиет форте	26	34	27	28	28	30	25	28,2±0,12	10,5
7. Гамарет	24	40	25	26	24	24	30	27,5±0,09	19,2
8. Анкопен П	22	40	20	27	29	23	16	25,2±0,09	31,4
9. Интрамаст	31	40	30	35	31	32	35	33,4±0,12	9,8
10. Цефурокс	27	40	28	29	28	35	40	32,4±0,09	13,2
11. Энроутеромаст ВБФ	30	36	30	30	35	34	30	32,1±0,12	6,1
12. Кобактан	25	27	27	27	22	22	20	24,2±0,12	9,5
M±m	27,1±0,09	35,4±0,07	26,3±0,07	29,9±0,07	28,9±0,07	27,5±0,07	27,7±0,07
Изменчивость по препаратам (CV)%	10,9	13,4	13,3	12,5	11,2	13,6	21,6

Исходя из данных таблицы 2, наиболее высокая чувствительность золотистого стафилококка к перечисленным препаратам отмечена во втором (35,4±0,07) и четвертом (29,9±0,07) хозяйствах. Из указанных в таблице препаратов наибольшим антибактериальным эффектом обладают Норфлоксамаст (32,2±0,09), Синулокс (32,4±0,09), Интрамаст (33,4±0,12), Цефурокс (32,4±0,09), Энроутеромаст ВБФ (32,1±0,12).

Кроме того, коэффициент вариации чувствительности золотистого стафилококка по препаратам варьирует в широких пределах (от 6,1 до 31,4 %). Так, «незначительная» изменчивость (не превышает 10%) показателя отмечена при использовании таких препаратов, как Мастинон форте (8,1%), Прималакт (7,0%), Интрамаст (9,8%), Энро-утеромаст ВБФ (6,1%), Кобактан (9,5%); «средняя» изменчивость (от 10 до 20%) - Диеномаст (19,7%), Норфлоксамаст (14,3%), Синулокс (18,3%), Мастиет форте (10,5%), Гамарет (19,2%), Цефурокс (13,2%) и «значительная» изменчивость (более 20%) - Анкопен П (31,4%).

Коэффициент вариации по хозяйствам к применяемым препаратам также варьирует. Так, «средняя» изменчивость показателя наблюдается с первого по шестое хозяйство (от 10,9 до 13,6%), «значительная» изменчивость в седьмом хозяйстве (21,6%), «незначительной» изменчивости не наблюдается.

Полученные результаты говорят о существенных колебаниях размеров зон задержки роста патогенного стафилококка как по комплексным препаратам, так и по хозяйствам. В связи с этим определение чувствительности выделенного микроорганизма (патогенного или условно-патогенного) к комплексным антибактериальным препаратам является актуальным и значимым для практикующих ветеринарных специалистов.

Рис. 1. Чувствительность золотистого стафилококка к комплексным антимикробным препаратам

Заключение. Нами предложен ориентировочный способ определения чувствительности микроорганизмов, выделенных из молока больных маститом коров, к комплексным антимикробным препаратам в виде суспензий и растворов, который дает возможность ветеринарным врачам хозяйств определиться в выборе того или иного препарата для лечения коров в период лактации и профилактики мастита в период сухостоя с наибольшей эффективностью.

Статья выполнена в соответствии с государственным заданием № 0578-2019-0003.

Список литературы:

1. Биометрическая обработка лабораторных, клинических и эпизоотологических данных// Новочеркасск, 1980.
2. ГОСТ 30347-2016 «Молоко и молочная продукция. Метод определения Staphylococcus aureus»// М., 2016.
3. Методические наставления «Комплекс мероприятий по снижению заболеваемости коров маститом и получению молока высокого санитарного качества»// Вологда-Молочное, 2012.
4. Методические указания по бактериологическому исследованию молока и секрета вымени коров// М., 1983.
5. Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам// М., 2004.
6. Тапальский Д.В., Лагун Л.В. Методы определения чувствительности к комбинациям антибиотиков грамотрицательных бактерий с экстремальной и полной антибиотикорезистентностью// УО «Гомельский государственный медицинский университет». 2017.
7. https://www.activestudy.info/sinergizm-i-potencirovanie-antibiotikov/

Резюме. Анализ результатов микробиологических исследований молока (секрета вымени) из хозяйств Вологодской, Ярославской и Костромской областей показал, что за 2020 год в спектре выделенной микрофлоры патогенная и условно-патогенная флора составила 85 культур (31,6%), молочнокислая и прочая непатогенная - 131 культуру (48,7%). При исследовании антибиотико-чувствительности применяли чистые культуры микроорганизмов: 11 штаммов золотистого стафилококка, 6 штаммов условно-патогенных стафилококков, 6 штаммов энтеробактерий и 4 штамма агалактийного стрептококка, выделенных из секрета вымени коров. В качестве комплексных антимикробных препаратов использовали 36 шприцев для внутривымянного введения, содержащих один, а также два и более антибиотиков. Чувствительность указанных выше микроорганизмов к антибактериальным препаратам определяли диско-диффузионным методом. В ходе работы авторами определена средняя зона задержки роста золотистого стафилококка на примере семи хозяйств и часто используемых ими комплексных антибактериальных препаратов. Полученные результаты указывают на существенные колебания размеров зон задержки роста патогенного стафилококка как по комплексным препаратам, так и по хозяйствам. В связи с этим определение чувствительности выделенного микроорганизма (патогенного или условно-патогенного) к комплексным антибактериальным препаратам является актуальным и значимым для практикующих ветеринарных специалистов. В соответствии с проведенными исследованиями авторами предложен ориентировочный способ определения чувствительности микроорганизмов, выделенных из молока больных маститом коров, к комплексным антимикробным препаратам в виде суспензий и растворов. Предлагаемый способ дает возможность ветеринарным врачам хозяйств определиться в выборе того или иного препарата для лечения коров в период лактации и профилактики мастита в период сухостоя с наибольшей эффективностью.

Ключевые слова: крупный рогатый скот, лактация, мастит коров, лечение, микроорганизмы, чувствительность, антибиотикорезистентность, комплексные антимикробные средства, раствор, суспензия, диско-диффузионный метод.

Сведения об авторах:

Семина Людмила Константиновна, кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник Вологодского филиала ФГБНУ «Федеральный научный центр -Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук»; 160009, г. Вологда, ул. Чехова, 10; e-mail: viev-mastit@yandex.ru.

Скулябина Зоя Александровна, старший научный сотрудник Вологодского филиала ФГБНУ «Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук»; 160009, г. Вологда, ул. Чехова, 10; e-mail: zengira@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Авдуевская Наталья Николаевна, соискатель, научный сотрудник Вологодского филиала ФГБНУ «Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук»; 160009, г. Вологда, ул. Чехова, 10; e-mail: natali.avduevskaya@mail.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей