УДК 639.3.09
DOI 10.33861/2071-8020-2026-1-29-31
Оригинальное эмпирическое исследование
Громова Е. А., Осянин К. А., Горбунова М. Е., Додонова Е. А., Зайнуллин Л. И. Федеральное государственное бюджетное
научное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»,
Республика Татарстан, г. Казань
Аннотация. Вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV) является возбудителем одной из опаснейших болезней рыб, циркуляция в водных экосистемах которого может приводить к значительным экономическим потерям в области аквакультуры. Целью данной работы явилась разработка способа идентификации вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани методом ПЦР-РВ.
Материалы и методы исследований. В работе использовали инактивированные штаммы вирусов: IHNV (n=1), VHSV (n=2) – возбудители вирусной геморрагической септицемии, и IPNV (n=1) – вирус инфекционного некроза поджелудочной железы (ФКП «Ставропольская биофабрика»).
Результаты исследований и их обсуждение. Разработаны две комбинации праймеров и зондов, мишенью для которых являются гены G и N, кодирующие белки вируса IHNV – гликопротеин и нуклеопротеин, соответственно. Также на основе плазмидного вектора «pET28» разработан положительный контроль, интегрирующий в себе искомую нуклеотидную последовательность двух маркерных областей. В результате серии экспериментов, проведенных на положительном контроле, была определена программа амплификации и состав реакционной смеси, оптимальные для проведения двухлокусной ПЦР-РВ. С использованием кДНК гетерологичных вирусных культур установлено, что разработанные праймеры обладают 100% специфичностью, а предел обнаружения вирусных частиц составляет 8,42?102 копий/ мкл.
Заключение. Для выявления возбудителя инфекционного некроза гемопоэтической ткани наиболее предпочтительным является применение двухшаговой обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакция, поскольку она обладает более высокой эффективностью по сравнению с одношаговой. Разработанные олигонуклеотидные затравки обладают всеми необходимыми характеристиками необходимыми для использования их в качестве основы тест-системы, позволяющей проводить быструю ПЦР-индикацию и идентификацию IHNV. Предложенный в рамках работы диагностический подход, использующий две мишени – гены G и N вируса IHNV, позволит идентифицировать наибольшее количество штаммов IHNV, учитывая при этом внутривидовое генетическое многообразие данного вируса.
Ключевые слова: болезни рыб, вирус инфекционного некроза гемопоэтической ткани, Rhabdoviridae, индикация, ОТ-ПЦР-РВ, молекулярная диагностика, специфичность, аналитическая чувствительность, генетические маркеры, праймеры.
Инфекционный некроз гемопоэтической ткани (IHN) представляет собой одну из наиболее опасных угроз для популяции лососёвых рыб, обитающих как в естественных водоёмах, так и в условиях аквакультуры [1]. Возбудителем данной болезни является высококонтагиозный вирус IHNV (Infectious hematopoietic necrosis virus), относящийся к роду Novirhabdovirus семейства Rhabdoviridae [2]. Данный вирус характеризуется высокой летальностью и, как следствие, способен нанести значительный экономический ущерб рыбоводческой отрасли [3, 4]. Степень патогенности IHNV в значительной мере зависит от его принадлежности к определённому генотипу. Например, некоторые генотипы проявляют более агрессивное течение инфекции, вызывая массовую гибель молоди без выраженных внешних симптомов, в то время как другие могут приводить к хроническому течению с более умеренной смертностью [5]. На сегодняшний день идентифицировано пять генотипов вируса IHNV: U (распространен на Дальнем Востоке России, в Северной Америке и Азии), M (Северная Америка, Европа), L (Северная Америка), E (Европа) и J (Япония, Корея) [2, 5].
Клиническая картина течения инфекции IHN характеризуется значительным разнообразием, однако можно выделить некоторые общие черты заболевания, а именно потемнение окраски кожи, вялость, снижение реакции на внешние раздражители (летаргия), экзофтальм (выпучивание глаз), бледность жабр, вздутие живота (асцит) и петехиальные кровоизлияния (мелкие точечные кровотечения) на коже и внутренних органах [5]. В тяжелых случаях, особенно при острой форме инфекции, смертность может достигать 100% за короткий промежуток времени, без каких-либо видимых внешних симптомов до момента гибели.
Вирус IHNV был впервые обнаружен в Российской Федерации в 2001 году на Камчатке у половозрелой нерки (Oncorhynchus nerka) [6]. В настоящее время случаи заболеваний фиксируются главным образом в рыбоводческих хозяйствах, что обусловлено, прежде всего, высокой плотностью посадки рыб, способствующей быстрому распространению инфекции. Экономический ущерб, наносимый аквакультурным хозяйствам от циркуляции IHNV, весьма значителен. Он складывается из высокого уровня летальности промысловой рыбы и её убоя, затрат на проведение карантинных мероприятий и введения ограничений на торговлю [7].
Инфекционный некроз гемопоэтической ткани рыб включен в список болезней, требующих государственного контроля [6]. В связи с этим не вызывает сомнений необходимость быстрой и точной диагностики IHN. Диагностика данной болезни может быть осуществлена с помощью комплекса лабораторных подходов, основанных на серологических методах, такие как ИФА (иммуно-ферментный анализ) и нейтрализующая реакция, позволяющих определить наличие антител к вирусу IHNV в сыворотке крови рыб. Вирусная РНК также может быть обнаружена с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции) в образцах тканей, крови или воде. Данный метод обладает значительными преимуществами, поскольку позволяет проводить индикацию и идентификацию инфекционного агента с высокой эффективностью и в кратчайшие сроки [8, 9]. Также с помощью метода ПЦР может быть реализована дифференциальная диагностика IHN, что необходимо для исключения других заболеваний со схожими симптомами, таких как вирусная геморрагическая септицемия (VHS), инфекционный некроз поджелудочной железы (IPN) и пр.
Целью работы явилась разработка способа идентификации вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани методом ПЦР-РВ.
Материалы и методы исследований. В качестве объектов исследования использовали инактивированные вирусные культуры штаммов IHNV (n=1), VHSV (n=2) – возбудители вирусной геморрагической септицемии и IPNV (n=1) – вирус инфекционного некроза поджелудочной железы (ФКП «Ставропольская биофабрика»). Для выделения РНК был применён комплект реагентов «РИБО-преп» («АмплиСенс», Россия). Обратную транскрипцию осуществляли с помощью набора «Реверта-L» («АмплиСенс», Россия). Все манипуляции с нуклеиновыми кислотами выполнялись в соответствии с протоколом производителя. Конструирование олиго-нуклеотидных затравок, пригодных для индикации IHNV, проводили с помощью программ «Vector NTI 9.1.0» и «BLASTn» согласно общепринятым методикам [2, 10, 11, 12]. Олигонуклеотидные затравки и положительный контроль были синтезированы в ЗАО «Евроген» (Москва). Постановку ПЦР-РВ проводили на ДНК-амплифи-каторе С1000 с оптическим блоком CFX96 («Bio-Rad», Сингапур) с использованием набора реагентов ЗАО «Синтол» (Россия).
Результаты исследований и их обсуждение. В качестве основы для конструирования праймерной системы для ПЦР-иден-тификации возбудителя IHN использовали подобранные нами ранее маркерные последовательности генов N и G, которые кодируют белки вируса IHNV – гликопротеин и нуклеопротеин, соответственно [2]. Действительно, гены N и G находят широкое применение при генотипировании вирусов IHNV и, как следствие, обладают высоким потенциалом для идентификации максимального количества известных штаммов данного вируса [2]. В пределах подобранных локусов разработали две пары праймеров и TagMan-зонды, пригодные для ПЦР-индикации IHN методом ПЦР в режиме реального времени. В качестве флуорофора и гасителя была выбрана комбинация (FAM) – (BHQ1). Специфичность разработанных праймеров была исследована с помощью онлайн утилиты BLASTn. Установлено, что разработанные праймеры и зонд обладают 100% гомологией к большинству депонированных в базе данных GenBank нуклеотидным последовательностям искомых генов вируса IHNV.
Для обеспечения контроля процесса амплификации был разработан положительный контроль, который представляет собой плазмидный вектор «pET28», содержащий искомую нуклеотидную последовательность двух маркерных областей.
В процессе подбора синтетических олигонуклеотидов было установлено, что оптимальная температура отжига для всех разработанных праймеров составила 55°C, а для зондов – 60°C. Для определения точной температуры отжига праймеров были проведены моноплексные реакции с разработанным положительным контролем с использованием температурного градиента (от 50 до 65°С). На основании полученных экспериментальных данных была составлена рабочая программа амплификации: начальная денатурация ДНК при 95°C в течение 5 мин, далее 5 циклов: денатурация при температуре 95°C – 10 с, отжиг олигонуклеотидов: при 58°C – 30 с, элонгация: при 72°C – 25 с; далее 39 циклов: денатурация при температуре 95°C – 10 с, отжиг олигонуклеотидов: при 58°C – 30 с (учет флуоресцентного сигнала по каналу FAM), элонгация: при 72°C – 25 с.
Также был определён оптимальный состав реакционной смеси для проведения индикации IHNV в формате двухлокусной ПЦР-РВ (табл. 1).
Таблица 1 Состав реакционной смеси для проведения ПЦР-РВ
| Обозначение праймера/зонда | Концентрация, мкМ | Реакционная смесь | |
|---|---|---|---|
| Компонент | Объем, мкл | ||
| IHNNF (прямой) | 0,4 | 10×ПЦР-буфер | 1,5 |
| IHNNR (обратный) | 0,4 | 25 мМ MgCl2 | 1,5 |
| IHNNP (зонд) | 0,3 | 2,5 мM dNTPs | 1,5 |
| IHNGF (прямой) | 0,4 | Taq ДНК-полимераза | 0,5 |
| IHNGR (обратный) | 0,4 | ДНК | 5 |
| IHNGP (зонд) | 0,3 | ddH2O | До 15 |
Кроме того, были установлены максимальные значения порогового цикла (Ct), при которых результат считается достоверным: ? 32. Также был проведен анализ чувствительности разработанной двухлокусной ПЦР-РВ. Для определения предела обнаружения вирусных частиц в анализируемом образце была проведена серия из 12-ти десятикратных разведений позитивного контроля из начальной концентрации 50 нг/ мкл, что соответствует 8,42?109 копиям на один микролитр (копий/ мкл), и до 5?10-10 нг/ мкл равной 8,42?10-2 копий/ мкл. Реакции проводили в трех повторностях. Минимальная концентрация IHNV в образце, при которой наблюдается положительная амплификация (Ct<32) для всех трех повторностей, составляет 5?10-6 нг/ мкл, что соответствует 8,42?102 копий/ мкл.
Исследование специфичности разработанных праймеров проводилось с применением кДНК штаммов возбудителей болезней рыб, представленных в разделе «Материалы и методы». Установили, что при амплификации кДНК штамма IHNV наблюдается ожидаемый рост сигнала по каналу FAM. Аналогичный результат был получен при амплификации с положительным контролем. При проведении ПЦР-РВ с кДНК вирусов VHSV и IPNV, используемых нами в качестве отрицательных контролей, флуоресценции по данному каналу зарегистрировано не было.
Также было проведено сравнение результативности двух стратегий детекции IHNV: двухшаговая и одношаговая обратная транс-крипция-ПЦР (ОТ-ПЦР). В первом случае для проведения ПЦР-РВ применяется кДНК, синтезированная на матрице РНК с помощью обратной транскрипции в результате отдельной реакции. Одношаговая ОТ-ПЦР, в свою очередь, объединяет оба этапа в одну реакцию, используя полимеразу с ревертазной активностью. В данном случае, программа амплификации дополняется предварительным этапом – обратная транскрипция при 37°C в течение 30 минут.
В эксперименте использовались пробы тотальной РНК и кДНК вируса IHNV, методами одношаговой и двухшаговой ОТ-ПЦР, соответственно. Анализ проводился с тройными повторами в моноплексном формате (амплификация одного целевого фрагмента за раз), используя пары праймеров, специфичных для гена G (гликопротеина) и гена N (нуклеопротеина) вируса IHNV.
Как видно из таблицы 2, положительный сигнал наблюдался только с праймерами, нацеленными на ген G. Отсутствие амплификации с праймерами к гену N указывает на высокую вероятность наличия мутаций в этом гене у исследуемого штамма IHNV. Это подтверждает важность использования двухлокусной ПЦР-РВ в потенциальном ПЦР-диагностикуме с целью уменьшения риска ложноотрицательных результатов, связанных с генетическим разнообразием штаммов вируса IHNV.
При сопоставлении двух стратегий детекции IHNV, наблюдалось более высокое значение Ct в пробах, полученных при проведении ПЦР-РВ с кДНК вируса IHNV, чем в образцах содержащих РНК. Более высокое значение Ct указывает на меньшее количество исходного генетического материала, доступного для амплификации, что свидетельствует о возможных потерях генетического материала в процессе обратной транскрипции в отдельной реакции.
Таблица 2 Сравнение результативности одношаговой и двухшаговой ОТ-ПЦР детекции IHNV
| Мишень | кДНК | РНК | ||
|---|---|---|---|---|
| Среднее значение Ct М±SD | RFU | Среднее значение Ct М±SD | RFU | |
| G ген | 19,6±0,5 | 2300±100 | 14,7 | 800±80 |
| N ген | – | – | – | – |
Примечания: Сt – пороговый цикл, RFU – относительный уровень флуоресценции.
Однако, несмотря на более высокое значение Ct, интенсивность флуоресценции в образцах с кДНК была значительно выше (примерно на 1 500 единиц) по сравнению с одношаговой ОТ-ПЦР. Таким образом, несмотря на потери генетического материала при двухшаговой ПЦР-РВ, уровень специфической амплификации в данной системе оказался выше, что свидетельствует о её большей эффективности.
Заключение. В рамках данной работы сконструированы две пары специфических праймеров и зондов TaqMan, мишенью для которых являются гены G и N, кодирующие белки гликопротеин и нуклеопротеин вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани, соответственно. Экспериментально было подтверждено, что специфичность разработанных олигонуклеотидов составляет 100%, а чувствительность может достигать 8,42?102 копий в образце. Также были определены оптимальные условия для проведения ПЦР-РВ и состав реакционной смеси. Установлено, что для проведения индикации возбудителя инфекционного некроза гемопоэтической ткани наиболее целесообразным является использование двухшаговой ПЦР-РВ, ввиду ее большей эффективности в сравнении с одношаговой. Таким образом, можно сделать вывод, что разработанная комбинация олигонуклеотидных затравок обладает всеми необходимыми характеристиками для использования в качестве основы для ПЦР-РВ тест-системы, предназначенной для выявления вируса IHNV. Такой диагностикум, основанный на использовании двух мишеней (гены G и N), позволит проводить эффективную идентификацию различных штаммов IHNV, учитывая внутривидовое генетическое разнообразие. Важным аспектом дальнейших исследований является оценка возможности применения данной праймерной системы в полевых условиях, что потребует дополнительной валидации и оптимизации.
Список литературы:
1. Cuenca A., Vendramin N., Olesen N. J. Analytical validation of one-step realtime RT-PCR for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV). Bulletin of The European Association of Fish Pathologists. 2020; (40 (6): 261-272.
2. Громова Е.А. [и др.]. Генетические маркеры для ПЦР-индикации вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых рыб. Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. 2024; (5): 88-94.
3. Балахнина К.А., Мельников В.П. Инфекционный некроз гемопоэтической ткани лососевых рыб (обзор). Ветеринария сегодня. 2024; (13 (2): 124-135.
4. Yong C. Y. [et al.]. Infectious hematopoietic necrosis virus: advances in diagnosis and vaccine development. PeerJ. 2019: e7151.
5. Purcell M. K. et al. Universal reverse-transcriptase real-time PCR for infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV). Dis Aquat Organ. 2013; (106 (2): 103-115.
6. Рудакова С. Л. [и др.]. Особенности циркуляции вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани в популяции нерки оз. Курильского (Камчатка). Исследования водных биологических ресурсов Камчатки и северо-западной части Тихого океана. 2021; (63): 89-101.
7. Доронин М. И., Пыльнов В. А., Мудрак Н. С. Разработка метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени для выявления вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых рыб. Научный альманах. 2015; (8 (10): 1052-1057.
8. Тарасова А. С., Перчун А. В., Мельников В. П. Применение полимеразной цепной реакции для выявления возбудителей некоторых особо опасных вирусных болезней рыб. Ветеринария сегодня. 2020; (1 (32): 11-16.
9. Arakawa C. K. [et al.]. Polymerase chain reaction (PCR) amplification of a nucleoprotein gene sequence of infectious hematopoietic necrosis virus. Dis. Aquat. Org. 1990; (8): 165-170.
10. Анисимова Е. А. [и др.]. Подбор оптимальных условий постановки ПЦР для идентификации возбудителя бруцеллеза собак. Вестник Алтайского государственно-
го аграрного университета. 2023; (12 (230): 55-59.
11. Громова Е. А. [и др.]. Разработка мультиплексной ПЦР-РВ тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза. Ветеринарный врач. 2024; (3): 34-40.
12. Хаммадов Н. И. [и др.]. Маркерные локусы генома бруцелл для дифференциальной ПЦР индикации патогенных штаммов. Проблемы особо опасных инфекций. 2018; (3): 88-93.
Сведения об авторах:
Осянин Константин Анатольевич, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории генотипирования и паспортизации штаммов ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок-2; e-mail: kostja-2003@mail.ru.
Горбунова Мария Евгеньевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярно-генетического анализа ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок-2; e-mail: maria.metax@bk.ru.
Додонова Екатерина Алексеевна, младший научный сотрудник лаборатории генотипирования и паспортизации штаммов ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок-2; e-mail: katya.dodonova.80@mail.ru.
Зайнуллин Ленар Ильгизарович, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории генотипирования и паспортизации штаммов ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок-2; e-mail: lenarilgizayn@mail.ru.
Ответственный за переписку с редакцией: Громова Елизавета Алексеевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории генотипирования и паспортизации штаммов ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, Республика Татарстан, г. Казань, Научный городок-2; e-mail: elizaveta-real@mail.ru.
Заявленный вклад авторов:
Громова Е. А.: разработка концепции, формальный анализ, проведение исследования, валидация результатов, валидация результатов, визуализация, написание черновика рукописи.
Осянин К. А.: разработка концепции, курирование данных, написание рукописи – рецензирование и редактирование.
Горбунова М. Е.: проведение исследования.
Додонова Е. А.: проведение исследования.
Зайнуллин Л. И.: административное руководство исследовательским проектом.
Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
http://www.vetkuban.com/num1_202608.html